猪三种细胞因子基因的克隆与序列测定

利用RTPCR技术，从植物凝集素(PHA)、脂多糖(LPS)诱导的猪外周血淋巴细胞(PBMC)中成功地克隆了IL-2,IL-4,IFN-α1基因，诱导后第6～24h细胞因子转录基因量最丰富；诱导剂LPS和PHA联合使用的效果优于LPS或PHA单独使用的诱导效果。序列测定与分析表明，克隆的IL-2,IL-4和IFN-α1基因与相应的参考序列的同源性分别是98．5％、99．0％和97．6％。     

荣昌猪自细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6（PIL-6）设计1对特异性引物，经刀豆蛋白素A（Co—nA）诱导猪淋巴细胞并提取总RNA，用1it—PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上，经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明：该基因cDNA全长741bp，开放阅读框由639个核苷酸组成，推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现：荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高，为99．8％。100％，氨基酸的同源性为99．5％-100％。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析，表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

北极狐白介素-18基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的犬白介素-18（IL-18）基因序列,设计了1对特异性引物。将北极狐外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导,用TRIzol裂解,提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增狐狸IL-18基因,连接pMD18-T载体,转化DH5d感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长590bp,含582bp的开放阅读框,编码193个氨基酸,与已知犬IL-18序列的同源性高达98．7％,氨基酸同源性为96．4％。     

荣昌猪白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6(PIL-6)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(ConA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上,经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明:该基因cDNA全长741 bp,开放阅读框由639个核苷酸组成,推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现:荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高,为99.8%~100%,氨基酸的同源性为99.5%~100%。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

鲤鱼白细胞介素-8全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析

用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A26,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明该克隆含有1个大小为294bp编码98个氨基酸的完整开放阅读框,氨基酸序列含有Chemokine-CXC功能结构域,前体中含有22个氨基酸组成的引导肽,氨基酸序列比对显示成熟白细胞介素-8(IL-8)多肽中第12、13和14构成CXC基序,但之前无ELR基序。系统发生分析其与荷兰鲤鱼亲缘关系最近,氨基酸序列的同源性达89%。分离培养鲤鱼外周血白细胞,在不同条件下经LPS、PHA和ConA刺激后,提取总RNA,根据鲤鱼IL-8全长cDNA序列和β-ac-tin序列设计引物,利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对鲤鱼外周血白细胞IL-8进行差异表达分析,结果显示,经有丝分裂原刺激后前期(4h)白细胞中IL-8的表达量明显增大,但随着时间推移(12、24h)并不一直比同期正常白细胞表达量大,表达量趋势成峰形图。     

犬脾细胞白介素-18(IL-18)基因的克隆与序列分析

为了研究白细胞介素-18(IL-18)的活性和功能，将犬脾细胞经ConA诱导，用TRIzol裂解，提取总RNA，通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出犬IL-18的cDNA，然后连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，获得阳性重组质粒。核苷酸序列结果表明，我们得到了长686bp的基因，含有一个582bp的开放阅读框架，编码193个氨基酸。与已知犬序列同源性可高达99．6％，与已知猪序列的同源性为89．8％，所克隆基因为今后进一步研究IL-18基因的功能奠定了基础。     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

绵羊白细胞介素-25两个突变体基因表达序列的研究

试验对绵羊白细胞介素-25(IL-25)基因表达序列进行了克隆和鉴定,结果发现,绵羊IL-25与人IL-25相同,也存在2个突变体。转录剪接体1(IL-25v1)有一个510bp的开放阅读框,编码169个氨基酸多肽,相对分子质量为19200;转录剪接体2(IL-25v2)开放阅读框为498bp,编码165个氨基酸多肽,相对分子质量为18710。两者的等电点均为8.0307。IL-25v1比IL-25v2长出的12bp编码5-端的MYQA肽,除此之外,其余序列均编码相同的氨基酸。系统发育分析结果显示,绵羊的2个IL-25突变体与牛和猪的IL-25位于同一分支。     

固始鸭白细胞介素-18全基因克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭IL-18cDNA基因序列设计、合成一对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如PHA等刺激脾淋巴细胞,直接提取脾淋巴细胞总RNA,扩增固始鸭IL-18基因,并克隆、测序。测序结果表明固始鸭IL-18基因全序列为610bp,包含1个完整阅读框,编码1条由200个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,固始鸭IL-18基因与GenBank中两条鸭IL-18基因(AF336122和DQ490137)核苷酸同源性分别为98.8%、99.8%,与AF336122有5个碱基发生非同义变异,2个碱基为同义变异,氨基酸同源性为97.5%,与DQ490137有一个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%。固始鸭IL-18前体蛋白第30位谷氨酸处有一个IL-1β转换酶的caspase-1切割位点及在人和其他动物中已证实的IL-1标签序列,推测鸭IL-18成熟蛋白由170个氨基酸组成。固始鸭与人和其他动物的IL-18基因进化分析表明,IL-18基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析

克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。     

羊IL-1Ra基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

试验旨在对羊白介素1受体颉颃因子（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）基因进行全长cDNA克隆及生物学分析。根据布鲁氏菌感染羊白细胞层SSH cDNA文库中的IL-1Ra基因序列信息及已知核苷酸序列（GenBank登录号：KC425613.1）设计引物，利用RT-PCR结合RACE方法扩增并克隆IL-1Ra基因，对其进行序列及相关分子特性分析。结果表明，羊IL-1Ra基因全长为1 228 bp，可编码174个氨基酸，含有1个完整的IL-1保守结构域和1个IL-1Ra结构域（PHA02651结构域）。IL-1Ra分子质量为19 765.8 u，等电点（pI）为5.72，其分子式为C₈₈₅H₁₃₈₅N₂₃₅O₂₅₆S₁₁，且含有信号肽。二级结构分析显示，IL-1Ra分子存在较多的β折叠及受体结合位点，与三级结构预测结果一致，且与人/鼠IL-1Ra分子的空间结构相似度极高，达到90%以上。羊IL-1Ra有IL-1特有的三叶草结构，其酶结合结构域位于TYR⁴⁷至GLU⁶⁶之间。将羊IL-1Ra与牛、虎鲸、宽吻海豚、猪、家犬、人、鼠等14个物种进行蛋白质同源性比对，发现在各物种间存在5个高度同源的半胱氨酸位点。系统进化树分析发现，羊IL-1Ra基因全长cDNA所编码的氨基酸序列同山羊、牛单独形成一个分支。本研究结果为今后深入研究IL-1Ra基因的生物学功能奠定了基础。     

猪(杜长大三元杂)白细胞介素-6基因的克隆及序列分析

分离猪(杜长大三元杂)外周血单核细胞(PBMC)进行体外培养,经诱导剂LPS或ConA的诱导培养48 h后,提取细胞总RNA,应用RT PCR扩增猪IL基因,并克隆到pMD18 T载体后测序。结果成功获得猪IL 6基因重组质粒pMDpIL 6,序列分析发现所获得的猪IL 6cDNA长度为716 bp,开放阅读框为636 bp,编码211个氨基酸,相对分子质量约24 ku,等电点5.5。所获得的猪IL6与GenBank上已报道的不同来源猪的IL 6有单个氨基酸存在差异;与人和其他动物IL 6氨基酸序列的同源性为78.1%~90.1%,同时反映出IL 6基因具有种的多样性,不同种动物的IL 6基因亲缘关系越近,进化关系也越近。     

海兰鸡白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析

白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列，自行设计一对引物，经植物血凝素（PHA）活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后，提取其总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列，其大小为597bp，与在GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现，中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致，为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析

为明确高丹草超低氢氰酸含量ISSR特征片段的DNA分子特征,以散穗高粱×黑壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段H-1、H-2、H-3和散穗高粱×白壳苏丹草杂种F2的3个超低氢氰酸含量ISSR特征片段B-1、B-2、B-3为材料,对6个不同的ISSR特征片段进行了克隆和测序分析.结果表明:克隆的特征片段H-1序列全长为1377bp,序列包含1个357bp的完整编码区(ORF),位于743～1099bp区域,共编码119个氨基酸,片段与小麦亚种蛋白b的同源性为60％.片段H-2序列全长2268bp,序列包含1个279bp的ORF,位于735～1013bp区域,共编码93个氨基酸,片段与高粱假设蛋白SORBIDRAFT_05g027190同源性为63.9％,与水稻粳稻组假设蛋白OsJ_07776同源性为62％.片段H-3序列全长2614bp,序列包含1个339bp的ORF,位于1024～1362bp区域,共编码113个氨基酸.片段B-1序列全长1432bp,序列包含1个300bp的ORF,位于700～999bp区域,共编码100个氨基酸.片段B-2序列全长1363bp,序列包含1个228bp的ORF,位于603～830bp区域,共编码76个氨基酸.片段B3序列全长2751bp,序列包含1个186bp的ORF,位于2534～2719bp区域,共编码62个氨基酸.片段H-3、B-1、B-2、B-3与现有已知的植物碱基序列和氨基酸序列没有同源性,可能是与高丹草超低氢氰酸含量关系更为密切的DNA新序列.     

中国白兔白介素-15基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达

以RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞（PMBCr）进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-15基因进行序列比较。结果IL-15基因全长489 bp,编码162个氨基酸,其中前29个氨基酸残基构成信号肽序列。与不同物种IL-15基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异。在推导的中国白兔IL-15氨基酸序列中,在108～110、119～121、127～129和143～146位存在4个潜在的N-联糖基化位点,同时存在6个Cys残基。将pTIL-15双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-15,转化大肠杆菌BL21（DE3）,并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为20 500的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

昆明鼠白细胞介素-15基因的克隆与序列分析

参照GenBank登录的小家鼠(Mus musculus)白细胞介素-15基因序列设计引物,利用RT-PCR技术对刚地弓形虫RH株诱导昆明(KM)鼠72 h后的脾细胞进行扩增,克隆得到了KM鼠的成熟IL-15核苷酸序列。经测序分析发现,KM鼠成熟IL-15序列长度为345 bp,编码114个氨基酸,与小家鼠IL-15序列相似性达到100%。序列比对和遗传进化分析表明,KM鼠成熟IL-15序列与挪威鼠亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为94.2%和95.5%;与土拨鼠、人、灵长类、兔、犬、猫、牛、野猪等哺乳动物亲缘关系相对较远,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为71.2%~78.8%和69.5%~74.7%;与珍珠鸟、非洲蟾蜍和斑马鱼亲缘关系最远,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为6.1%~50.9%和16.1%~32.5%。KM鼠IL-15基因的成功克隆为进一步研究其功能及免疫增强作用奠定了基础。     

鸡白介素17A的克隆表达及活性测定

从经人工感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊(1×104个/只鸡)的盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)提取总RNA,用RT-PCR方法成功扩增了鸡白介素17A(IL-17A)基因,测序结果显示,开放阅读框为453bp,编码150个氨基酸,与GenBank上鸡IL-17A基因(AM773756)的核苷酸和氨基酸序列完全一致(100%),与报道的哺乳动物IL-17A的氨基酸相似性达37%～46%。构建的pGEX-6p1-chIL-17A原核表达载体经1mmol/L IPTG诱导后表达出43kDa左右的融合蛋白,与预期大小一致,且Western-blot鉴定表达产物为目的蛋白。功能试验表明,表达的重组鸡IL-17A能够刺激鸡胚成纤维细胞产生IL-6。这些结果表明,鸡IL-17A在结构和功能方面与哺乳动物的IL-17A都有一定的相似性,可能在鸡的免疫应答过程中起到重要的作用。