羊IL-1Ra基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

试验旨在对羊白介素1受体颉颃因子(interleukin-1receptor antagonist,IL-1Ra)基因进行全长cDNA克隆及生物学分析。根据布鲁氏菌感染羊白细胞层SSH cDNA文库中的IL-1Ra基因序列信息及已知核苷酸序列(GenBank登录号:KC425613.1)设计引物,利用RT-PCR结合RACE方法扩增并克隆IL-1Ra基因,对其进行序列及相关分子特性分析。结果表明,羊IL-1Ra基因全长为1 228bp,可编码174个氨基酸,含有1个完整的IL-1保守结构域和1个IL-1Ra结构域(PHA02651结构域)。IL-1Ra分子质量为19 765.8u,等电点(pI)为5.72,其分子式为C_(88)5H_(1385)N_(235)O_(256)S_(11),且含有信号肽。二级结构分析显示,IL-1Ra分子存在较多的β折叠及受体结合位点,与三级结构预测结果一致,且与人/鼠IL-1Ra分子的空间结构相似度极高,达到90%以上。羊IL-1Ra有IL-1特有的三叶草结构,其酶结合结构域位于TYR~(47)至GLU~(66)之间。将羊IL-1Ra与牛、虎鲸、宽吻海豚、猪、家犬、人、鼠等14个物种进行蛋白质同源性比对,发现在各物种间存在5个高度同源的半胱氨酸位点。系统进化树分析发现,羊IL-1Ra基因全长cDNA所编码的氨基酸序列同山羊、牛单独形成一个分支。本研究结果为今后深入研究IL-1Ra基因的生物学功能奠定了基础。     

梅花鹿S100A16基因的克隆及生物信息学分析

为探索梅花鹿（Cervus nippon）S100A16基因序列及生物学特性，本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物，以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得梅花鹿S100A16基因的cDNA序列。生物信息学分析发现，梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp，编码103个氨基酸；蛋白含有11个磷酸化位点，有跨膜结构域，无信号肽，为在细胞内发挥作用的稳定蛋白；蛋白仅在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域，由12个氨基酸组成，N端EF螺旋结构域由15个氨基酸组成；蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点；梅花鹿S100A16蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；三级结构显示该蛋白有2个Ca²⁺结合位点；梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高，为100%，与其他部分物种S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树，分析表明S100A16基因在进化上比较保守，符合功能基因的特点。研究结果为进一步揭示梅花鹿S100A16基因的功能及表达机制提供依据。     

贵州黑山羊独立生长因子1B基因cDNA克隆与生物信息学分析

选择与羊同源性较高的牛独立生长因子1B(GFI1B)基因序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对GFI1B基因进行克隆测序及序列分析。结果表明:首次克隆了贵州黑山羊GFI1B基因cDNA序列996 bp,GenBank登录号为JN662390,编码331个氨基酸。贵州黑山羊GFI1B基因与牛的同源性高达97.0%。聚类分析显示:哺乳动物、禽类和两栖类各为一类。生物信息学分析表明:山羊GFI1B分子包括1个低组分复杂性区域、6个锌指结构域ZnF-C4。同时,预测结果还表明GFI1B分子不包含信号肽序列且没有跨膜螺旋结构域,26个磷酸化位点,蛋白糖基化位点有7个。     

山羊小热休克蛋白Hspb10基因cDNA克隆及序列分析

通过RT-PCR和RACE方法克隆了山羊Hspb10基因cDNA序列并进行了序列分析。结果表明:山羊Hspb10 cDNA全长1 056 bp,编码区全长780 bp,共编码259个氨基酸,提交至GenBank数据库中,收录号为JX067553。用Clustal W方法比对不同物种氨基酸序列同源性,山羊Hspb10与牛的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.4%和96.5%;编码氨基酸序列BLAST比对结果也表明,哺乳动物Hspb10氨基酸序列极为保守,与禽类差异较大。获得山羊Hspb10 cDNA序列,可以为分子水平上研究山羊Hspb10的生物学功能奠定基础。     

牛GUCY1A3和SFXN1基因的克隆及生物信息学分析

试验以人GUCY1A3和SFXN1基因序列为探针,BLAST获得同源性较高的牛的表达序列标签（ESTs）序列及部分mRNA序列。通过RT-PCR方法从牛肌肉及脑组织克隆cDNA序列与牛表达序列标签进行拼接,获得牛GUCY1A3和SFXN1基因,并对其进行了生物学特性分析。序列分析表明,牛GUCY1A3基因编码区长2 076 bp,编码691个氨基酸;牛SFXN1基因编码区长969 bp,编码322个氨基酸。氨基酸序列分析表明,GUCY1A3蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在细胞质中,不属于分泌蛋白,二级结构预测以α螺旋为主,保守结构域含1个CYCc功能结构域;SFXN1蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在内质网和浆膜上,属于跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,保守结构域含1段低复杂度序列和3段跨膜螺旋区。试验结果为进一步研究牛GUCY1A3和SFXN1基因的表达调控机制与功能奠定了基础。     

绵羊PDGFD基因克隆及其在不同部位脂肪组织中的表达

试验旨在获得绵羊血小板源性生长因子D （PDGFD）基因的编码区（coding sequence，CDS）全长序列，并了解其在体内不同部位脂肪组织中的表达规律。以阿勒泰母羊和中国美利奴母羊为研究对象，克隆获得了PDGFD基因CDS区全长序列并对其进行了生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR方法对PDGFD基因在2个品种羊沉积在尾部、肠系膜、背部和肾脏周围4个不同部位脂肪组织中的表达水平进行定量分析。结果显示，绵羊PDGFD基因CDS区序列长度为1 113 bp，编码370个氨基酸；PDGFD基因CDS区序列及其编码序列与山羊的相似性最高，其次是牛、猪、马、人，与鼠的相似性最低，系统进化树分析结果与其一致；预测PDGFD蛋白属于稳定的亲水性蛋白，且无跨膜区，存在信号肽序列，属于分泌型蛋白；PDGFD蛋白含有1个糖基化位点、1个CUB结构域和1个PDGF结构域，PDGFD蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲构成，三级结构与结构域和二级结构分析结果基本吻合。实时荧光定量PCR结果显示，PDGFD基因在阿勒泰羊4个脂肪组织的表达量均高于中国美利奴羊，其中阿勒泰羊尾脂和背部脂肪的表达量显著高于中国美利奴羊（P<0.05）。本研究结果为进一步探究PDGFD基因在绵羊脂肪沉积中的作用机制提供参考。     

寒泊羊脂联素基因表达及生物信息学分析

试验旨在探究脂联素（adiponectin，ADIPOQ）基因在不同月龄寒泊羊背最长肌组织中的表达规律及生物学特征。采用实时荧光定量PCR方法对3个不同时期（1、7、13月龄）寒泊羊背最长肌组织中ADIPOQ基因mRNA表达水平进行检测，并利用生物信息学方法分析ADIPOQ基因的核苷酸及编码氨基酸序列分子结构特征、蛋白特性及网络互作蛋白。结果显示，ADIPOQ基因在1、7、13月龄寒泊羊背最长肌组织中均有表达，并随着月龄增加呈现增加趋势，无显著性差异（P>0.05）。绵羊ADIPOQ基因核苷酸及氨基酸序列与山羊（98.60%和99.00%）、牛（98.60%和87.00%）的同源性较高。蛋白理化性质分析发现，ADIPOQ蛋白分子式为C₁₁₇₂H₁₇₇₆N₃₁₄O₃₄₉S₅，分子质量为26.00 ku，理论等电点（pI）为5.88，推测该蛋白为酸性蛋白；ADIPOQ亲水性总平均值（GRAVY）为－0.403，推测该蛋白为亲水性蛋白，不属于跨膜蛋白；信号肽序列为Met¹~Ala¹⁷，切割位点在Ala¹⁷和Arg¹⁸之间；在45－101位氨基酸处存在Collagen结构域，101－237位氨基酸处为C1Q保守结构域；二级结构主要以无规则卷曲为主（66.95%）。蛋白互作网络构建分析表明，该蛋白主要与ADIPOR1、ADIPIR2、CDH13和LEP蛋白具有互作关系。本研究结果为进一步深入探讨寒泊羊ADIPOQ基因在肌肉发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。     

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。     

牛干扰素调节因子9基因的克隆、序列分析与抗原优势区表达

本研究旨在克隆牛干扰素调节因子9（bovine interferon regulatory factor 9，BoIRF9）基因，分析其生物学信息，并表达其抗原优势区。从感染水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的EBK细胞中提取总RNA，以反转录得到的cDNA第一条链为模板，参考GenBank中牛IRF9基因序列设计特异性引物进行BoIRF9基因的扩增，对克隆得到的BoIRF9基因进行分子特征、高级结构与分子进化等生物学分析。根据BoIRF9的亲水性、抗原指数和表面可及性，设计1对特异性引物克隆BoIRF9的抗原优势区域片段，将其连接至pET30a（+）载体，构建重组表达质粒pET30a-IRF9-Part。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，经IPTG诱导表达抗原优势区域蛋白，运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定。结果显示，本研究克隆得到BoIRF9基因全长1 684 bp，CDS区长1 320 bp，编码439个氨基酸；BoIRF9氨基酸序列与人、马、猪、山羊相似性为80.0%~96.2%；进化树分析结果显示，荷斯坦奶牛与山羊亲缘关系最近，其次为猪、马、非洲象和人；BoIRF9蛋白的分子式为C₂₁₃₉H₃₃₄₂N₅₉₄O₆₅₈S₁₈，分子质量为48.5 ku，理论等电点（pI）为5.71；BoIRF9基因编码蛋白不存在跨膜结构，无信号肽，存在1个潜在的N-糖基化位点和多个磷酸化位点；BoIRF9蛋白二级结构含有115个α-螺旋、22个β-转角、68个延伸链和234个无规则卷曲；BoIRF9蛋白包含2个保守结构域，选择包含第一个保守结构域的第12－221位氨基酸作为抗原优势区域，克隆出648 bp的基因片段，并表达出分子质量为27 ku的重组蛋白。本研究结果可为干扰素调节因子的深入研究提供参考。     

小尾寒羊白介素1β全长cDNA序列克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆白介素1β(IL-1β)全长cDNA,为深入研究其生物学功能提供全长cDNA信息和试验材料.本试验利用前人构建的布鲁氏菌强、弱毒株感染小尾寒羊白细胞层抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库,获得小尾寒羊IL-1β部分cDNA序列信息,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE),克隆小尾寒羊IL-1β全长cDNA,并申请GenBank登录号KC425612.2.该cDNA全长1494 bp,含有801 bp开放阅读框(ORF),可编码266个氨基酸残基,预测其编码蛋白分子质量为30.622 ku,与林麝、牛、海豚、虎鲸的IL-1β一致性较高,亲缘关系较近.     

滩羊TCHH基因CDS区遗传结构及表达模式分析

试验旨在分析滩羊TCHH基因的遗传结构，并检测该基因在同一月龄不同组织及不同月龄皮肤组织中的表达模式。通过基因同源扩增获得滩羊TCHH基因编码区（CDS）全长，并利用生物信息学技术对序列的同源性、蛋白基本性质及重复序列特征进行分析，同时利用半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR对该基因在皮肤组织中的表达模式进行分析。结果显示，TCHH基因CDS区全长4 425 bp，包含两段重复序列，共编码1 474个氨基酸，滩羊TCHH氨基酸序列在物种内同源性较高，与山羊同源性可达96.3%，物种间的同源性较差，与人和家鼠的同源性分别为48.4%和40.5%。TCHH蛋白分子式为C₈₀₀₆H₁₃₁₈₇N₂₇₈₇O₂₆₆₁S₆，分子质量大小为191.26 ku，理论等电点为5.76，为亲水蛋白，其蛋白不稳定指数为119.37，稳定性较差。TCHH蛋白的氨基酸序列共包含2个保守区，分别为S-100型钙结合域和蛋白激酶结构域，富含α-螺旋，高达89.89%，推测其二级结构为长条棒状分子结构。组织表达谱结果发现，TCHH基因在皮肤组织中特异性表达，其mRNA表达量随着滩羊月龄的增加逐渐降低，与滩羊毛发卷曲性状的生长趋势一致，TCHH基因特殊的结构和表达模式表明该基因在滩羊的毛发卷曲性状中发挥着重要作用。本研究可为滩羊毛发生长的生物学机制研究提供重要的参考依据。     

绵羊磷脂酶C-γ1基因克隆及生物信息学分析

本研究旨对绵羊磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）基因预测序列进行筛选鉴定,获取PLC-γ1基因序列并对其生物信息学进行分析。根据GeneBank （登录号：NC_040264.1）及Ensembl （登录号：ENSOARG00000001700.1）给出的绵羊PLC-γ1的4种不同预测的转录本的编码区（CDS）区进行BLAST对比,在非同源区内两端设计引物,从绵羊卵巢提取总RNA并转录成cDNA,运用RT-PCR方法扩增该特异性片段,胶回收后测序,经BLAST比对筛选出和与该片段一致基因序列。根据筛选序列的引物,运用LA Taq（GC Buffer）髙保真酶对绵羊PLC-γ1基因进行PCR扩增,胶回收产物连接PUC57-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选单克隆进行测序。利用生物信息学技术对该基因及编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,试验成功扩增出非同源片段330 bp,经BLAST对比分析,预测的转录本X3预测序列与其一致,连接PUC57-T载体,经测序成功扩增3 870 bp的绵羊PLC-γ1基因。绵羊PLC-γ1基因与山羊关系紧密,与牛、马、猪等家畜具有较强的进化关系,蛋白分子式为C₆₅₈₂H₁₀₁₆₀N₁₈₁₂O₁₉₆₂S₅₈。理论分子质量为147.9 ku,存在于细胞质内,且不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性弱酸不稳定蛋白。该基因N、C端GC含量偏高,分别达80%、70%以上,具备SH2、SH3、C2等高度保守结构域,二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为36.46%、16.14%、5.04%和42.36%,磷酸化位点有112个,Y428、Y509和S514为关键磷酸化位点。本研究结果为绵羊PLC-γ1蛋白表达研究提供了理论依据,对研究新疆地方品种羊的胚胎发育、提高受精率等具有重要意义。     

Expression and Bioinformatic Analysis of ADIPOQ Gene in Hanper Sheep

The aim of this study was to investigate the expression and biological characteristics of adiponectin (ADIPOQ) gene in longissimus dorsi muscle of Hanper sheep at different months of age.The ADIPOQ gene mRNA expression was detected in longissimus dorsi muscle of Hanper sheep at 3 different growth periods (1,7 and 13 months old) by Real-time quantitative PCR.The bioinformatics method was used to analyze the nucleotide and amino acid sequences of ADIPOQ gene,protein characteristics and network interaction protein.The results showed that ADIPOQ gene was expressed in longissimus dorsi muscle of Hanper sheep,which showed an increasing trend with the growth of the months age without significant difference (P>0.05).There was higher homology of ADIPOQ gene with Capra hircus (98.60%,99.00%) and Bos taurus (98.60%,87.00%) in nucleotide and amino acid sequences.The results of physical and chemical properties analysis showed that the molecular formula of ADIPOQ protein was C₁₁₇₂H₁₇₇₆N₃₁₄O₃₄₉S₅,the molecular mass was 26.00 ku,and the theoretical isoelectric point (pI) was 5.88,which suggested that the protein was acidic.The average value of ADIPOQ hydrophilic protein (GRAVY) was －0.403,which indicated that the protein was hydrophilic and didn’t belong to transmembrane protein.In addition,the signal peptide sequence was Met¹-Ala¹⁷,and the cleavage site was between Ala¹⁷ and Arg¹⁸.ADIPOQ existed collagen structure domain and C1Q conserved structure domain at position 45－101 and 101－237,respectively.The secondary structure mainly composed of random coil (66.95%).The construction of protein interaction network indicated that ADIPOQ might interact with ADIPOR1,ADIPOR2,CDH13 and LEP.The results provided a theoretical basis for further exploring the molecular biological functions of ADIPOQ gene in the process of muscle development in Hanper sheep.     

绵羊SUN2基因生物信息学分析及其在A549细胞中的表达

本研究旨在克隆绵羊SUN2（Sad1 and UNC84 domain containing 2）基因并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测其在A549细胞中的表达。根据绵羊SUN2基因序列（GenBank登录号：XM_015095026.2）设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增并克隆绵羊SUN2基因CDS序列,测序鉴定后对其进行生物信息学分析,并构建pEGFP-C1-SUN2重组质粒。利用脂质体转染方法将pEGFP-C1-SUN2重组质粒转染至A549细胞并检测其表达。结果显示,绵羊SUN2基因CDS区序列全长2 187 bp,编码728个氨基酸,理论分子质量为81.06 ku,分子式为C₃₅₉₃H₅₆₃₉N₁₀₃₁O₁₁₁₀S₁₄,等电点（pI）为6.20,总原子数为11 387,不稳定系数为56.88,属于不稳定蛋白。绵羊SUN2基因序列与山羊、牛、猪、马、家犬、大鼠、小鼠及人的相似性分别为98.9%、97.2%、91.6%、90.6%、87.1%、82.4%、82.1%和86.1%,不同物种间基因相似性较高,进化过程中相对保守。系统进化树分析表明,绵羊SUN2基因与山羊、牛、猪、马和家犬等哺乳动物的遗传距离相对较近,与鸡的遗传距离较远。结构域及跨膜结构域预测显示,绵羊SUN2蛋白含有1个高度保守的SUN结构域,且存在跨膜结构域。信号肽预测显示其不存在信号肽位点,疏水性分析为亲水性蛋白,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋（51.65%）,其余为无规则卷曲（31.46%）、延伸链（12.36%）和β-转角（4.53%）。试验成功构建了绵羊SUN2基因真核表达载体pEGFP-C1-SUN2,将其转染至A549细胞并检测到蛋白表达。本试验结果为绵羊SUN2基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究SUN2基因在绵羊肺腺瘤病中的作用奠定了基础。     

哈萨克羊INHβA基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆哈萨克羊抑制素βA （inhibin beta A，INHβA）基因序列，并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中绵羊INHβA基因序列（登录号：NM_001009458.1）设计1对特异性引物，通过RT-PCR方法对哈萨克羊INHβA基因进行扩增，将获得的INHβA基因片段插入到pMD19-T载体中进行克隆测序，并结合生物信息学方法预测和分析其核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白跨膜、蛋白修饰位点及二级结构、三级结构模型等。结果显示，哈萨克羊INHβA基因长1 278 bp，编码425个氨基酸。哈萨克羊INHβA基因与绵羊、牛、野猪、小鼠、人、大鼠、猫、兔、马的同源性分别为98.6%、97.7%、90.4%、87.9%、91.1%、88.2%、91.8%、89.8%和91.8%，表明INHβA基因在不同物种之间具有较高的保守性。INHβA蛋白分子式为C₂₀₇₂H₃₃₂₅N₆₀₃O₆₂₈S₂₆，分子质量为47.57 ku，理论等电点（pI）为7.87，不稳定系数为66.16，脂溶指数为78.47，亲水值为-0.507。INHβA是一种碱性不稳定的亲水性脂溶性蛋白，没有跨膜结构，含有信号肽。二级结构预测显示，INHβA蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占22.59%、4.47%、54.12%和18.82%。三级结构预测显示，INHβA蛋白以α-螺旋为主，是含有8种蛋白修饰位点的β-桶状蛋白。本试验结果为深入研究哈萨克羊INHβA蛋白功能及探讨INHβA基因对提高哈萨克羊繁殖力的影响提供参考数据。     

斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析

试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白（glycoprotein，GP）抗原基因，并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA，反转录合成cDNA，设计特异性引物以扩增GP基因CDS区，同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序，并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明，GP基因开放阅读框（ORF）全长1 149 bp，编码382个氨基酸，其分子式为C₁₇₆₀H₂₈₇₈N₄₅₈O₅₉₀S₁₇₆₀，理论分子质量约为40.15 ku，等电点为4.37，无信号肽，总平均亲水性为0.032，不稳定系数为42.43，是疏水、不稳定蛋白；其磷酸化位点分布位于丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上；二级结构分析显示，斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主，与三级结构预测结果一致；抗原表位预测表明，GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位，有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因，同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测，为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。