鲤鱼外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28全长cDNA的克隆与差异表达分析

对DD-RTPCR获得的差异显示片段C15进行地高辛标记后作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得阳性克隆DM7。测序分析表明,该阳性克隆长1 097 bp,具有完整的开放阅读框架,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28的全长cDNA,编码249个氨基酸,含有PA28的α和β亚单位功能结构域,与已报道的斑马鱼的蛋白酶体激活因子PA28的同源性达93%。分离鲤鱼外周血白细胞,经有丝分裂原在不同条件下刺激后,利用Trizol提取总RNA,根据得到的PA28全长cDNA序列和鲤鱼β-actin的序列,设计引物,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定白细胞中PA28基因mRNA表达量的变化。结果表明,白细胞经LPS、ConA刺激后,PA28基因的mRNA表达量有所增加,但并不随时间的延长而持续增加。     

鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶全长cDNA克隆及其在外周血白细胞中的差异表达分析

试验旨在获得鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)cDNA全长序列,并以此为基础探讨在丝裂原刺激下外周血白细胞中iNOS的表达变化。以从鲤鱼正常外周血白细胞cDNA文库中获得的iNOS的EST序列为基础,采用基因文库筛选和cDNA5'末端快速扩增技术(5'-RACE)相结合的方法,成功扩增出鲤鱼iNOScDNA全长序列,然后进行鲤鱼外周血白细胞原代培养,分成对照组和试验组,其中试验组分别为脂多糖(LPS,1.0μg/mL)刺激4、12h,刀豆蛋白A(ConA,1.0μg/mL)刺激4、24h,对照组为相同培养时间无丝裂原刺激的外周血白细胞,根据得到的iNOScDNA全长序列和鲤鱼β-actin序列分别设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测各组外周血白细胞中iNOS在mRNA水平上的表达情况并进行分析。序列分析结果显示,最后获得的cDNA片段共3704bp,包含74bp的5'端非编码区,246bp的3'端非编码区,一个3384bp的完整的开放阅读框(ORF),共编码1127个氨基酸。序列同源性分析结果显示,该序列与鲫鱼iNOS基因同源性高达100%;实时荧光定量PCR结果显示,经LPS、ConA刺激的试验组外周血白细胞中iNOS表达量均升高,且短时间(4h)刺激的表达量高于长时间(LPS12h;ConA24h)刺激的表达量。综上所述,在LPS、ConA刺激过程中,iNOS在外周血白细胞中表达量均有上调,结果提示存在炎症反应的动态变化。     

鲤鱼肿瘤坏死因子受体相关因子6全长cDNA克隆及序列分析

本试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)EST序列为基础,经地高辛标记后作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从重组噬菌体中经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含有5'-非编码区(5'-UTR) 25 bp;3'-非编码区(3'-UTR) 535 bp,存在2个mRNA不稳定基序ATTTA;开放阅读框ORF长1632 bp,编码543个氨基酸。预测蛋白质等电点为5.88,分子质量大小为61.773 ku。序列同源性比对结果表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼TRAF6a基因同源性达99%。蛋白质序列分析结果发现,其具有TRAF家族的典型序列特征。     

鲤鱼肿瘤坏死因子α1基因cDNA的克隆及序列分析

试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子α1(tumor necrosis factor alpha 1,TNFα1) EST序列为基础,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.9×10⁴个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得3个阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含128 bp的5''非编码区(5''-UTR),423 bp的3''非编码区(3''-UTR),开放阅读框ORF长768 bp,共编码255个氨基酸,在其3''非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。预测蛋白等电点为8.20,分子质量大小为28.1 ku。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼TNFα基因的同源性达94%。蛋白质的序列和结构分析结果发现,其具有TNF家族的典型序列特征、1个跨膜区结构和1个假定的产生成熟肽的裂解位点。     

鲤鱼白细胞介素10基因组DNA克隆及序列分析

为获得鲤鱼白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)全长基因组序列,本研究利用鲤鱼IL-10全长cDNA序列(GenBank登录号:JX524550),通过在两端非编码区设计引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组为模板,使用PCR方法成功获得鲤鱼IL-10全长基因组序列。鲤鱼IL-10基因组全长2176 bp,GenBank登录号为JX524551。将所获得的序列与其他物种IL-10基因组序列相比,结果发现都含有5个外显子,4个内含子,外显子在进化上相对保守,剪切位点都符合"gt......ag"规则;序列包含540 bp的开放阅读框,编码179个氨基酸,有2段典型的IL-10氨基酸信号基序。     

荣昌猪白细胞介素-2和白细胞介素-4基因的克隆与序列分析

将荣昌猪外周血淋巴细胞在刀豆素A(ConA)的刺激下培养24~70 h后,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)cDNA,克隆到pMD18-T载体并测序。结果表明:克隆的IL-2 cDNA全长为522个碱基,ORF为465个碱基,编码154个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-2比对同源性均为99.8%;克隆的IL-4 cDNA全长411个碱基,ORF为402个碱基,编码133个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-4比对同源性均在98.0%以上,从而证实成功克隆了荣昌猪IL-2和IL-4基因cDNA。     

长白猪IL-4基因克隆及真核表达载体的构建

将长白猪外周血淋巴细胞在刀豆素A(ConA)的刺激下培养24 h后,提取其总RNA,应用RT-PcR技术扩增白细胞介素-4(IL-4)cDNA,克隆到pMD19-T载体并测序.将构建好的载体双酶切并回收目的片段与pcDNA3.1(+)载体连接并转化入Top10中构建真核表达载体,真核表达载体经双酶切及测序结果表明:克隆的IL-4 cDNA全长为411个碱基,其中ORF为402个碱基,编码133个氨基酸,与GenBank公布的猪IL-4比对同源性为100%,从而证实成功构建了长白猪IL-4 cDNA真核表达载体.     

牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析

克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。     

草鱼脂酰辅酶A合成酶4基因全长cDNA分子克隆及表达调控

本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂0、3、6、12和24 h后草鱼肝胰脏中ACSL4基因表达情况进行研究。结果显示:草鱼ACSL4基因cDNA全长2 418 bp,其开放阅读框2 121 bp,共编码706个氨基酸;草鱼ACSL4蛋白的氨基酸序列包含1个跨膜结构域、1个脂肪酸绑定基序和1个ATP/AMP绑定基序。草鱼ACSL4 mRNA在大脑和脾脏中相对表达量较高,显著高于其他组织(P <0.05),在肌肉中相对表达量最低;投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05);饥饿再投喂12 h后,草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量达到最高值,显著高于其他时间段(P<0.05),24 h后恢复至最初水平。本试验从草鱼10种混合组织中克隆了ACSL4基因全长cDNA,其所编码的氨基酸序列的主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ATP/AMP绑定基序在不同物种间高度保守;草鱼ACSL4基因主要在大脑和脾脏中表达;饲料中淀粉源对草鱼肝胰脏中ACSL4基因的表达无显著影响;在饥饿再投喂12 h后,草鱼肝胰脏中ACSL4 mRNA相对表达量达到最高值,随后显著下降至最初水平。     

小尾寒羊白介素1β全长cDNA序列克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆白介素1β(IL-1β)全长cDNA,为深入研究其生物学功能提供全长cDNA信息和试验材料.本试验利用前人构建的布鲁氏菌强、弱毒株感染小尾寒羊白细胞层抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库,获得小尾寒羊IL-1β部分cDNA序列信息,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE),克隆小尾寒羊IL-1β全长cDNA,并申请GenBank登录号KC425612.2.该cDNA全长1494 bp,含有801 bp开放阅读框(ORF),可编码266个氨基酸残基,预测其编码蛋白分子质量为30.622 ku,与林麝、牛、海豚、虎鲸的IL-1β一致性较高,亲缘关系较近.