柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶2A基因的克隆表达及转录动态分析

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)组蛋白去乙酰化酶2A(Et Sir2A)的生化功能及其对生活史发育的潜在调节作用,以柔嫩艾美耳球虫甘肃株为例,检测其在不同发育阶段表达量的差异。以基因组数据预测的编码序列为模板设计引物,采用RT-PCR的方法扩增得到Et Sir2A的全长ORF,构建p MAL-C2X-Et Sir2A重组表达质粒并进行原核表达;提取未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段/时期的总RNA,采用qRT-PCR方法检测Et Sir2A的转录动态变化。测序结果显示,克隆的Et Sir2A ORF序列全长909 bp,编码302个氨基酸,并能在大肠杆菌原核系统中成功表达;qRT-PCR结果显示,Et Sir2A在不同发育阶段mRNA转录水平差异显著,在未孢子化卵囊阶段最高,第二代裂殖子阶段最低。结果为进一步研究Et Sir2A功能和开发新型抗球虫药物提供了数据基础。     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

柔嫩艾美耳球虫含HD结构域蛋白特性和功能初步研究

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。     

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)与柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)卵囊于29℃静态系统中孢化。以30min为间隔，对卵囊孢子发育的4个阶段在显微镜下进行观察。以1h为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间(MST)。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在卵囊孢化过程中第20h时子孢子形成的卵囊百分率。E.acervulina与E.tenella的MST分别为11b与18b。卵囊浓度和悬液深度与孢子发育时间呈明显反比关系。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG）基因的分离及鉴定

利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

肉用仔鸡球虫病的诊断与防治

鸡球虫病是一种对养鸡业危害极大的寄生原虫病,病原包括9种艾美耳属球虫,其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)及毒害艾美耳球虫(E.necatrix)致病性最强。集约化的商品肉鸡养殖场是球虫病暴发的最适宜场所。雏鸡感染球虫后,大量肠上皮细胞受损,出血。主要特征是患鸡消瘦、贫血和血痢。病愈的小鸡在长时间内不易复原,严重者死亡,其病死率有时高达40%。1病原及流行病学诊断1.1球虫生活史以柔嫩艾美耳球虫为例。鸡吞食了已孢子化的卵囊,卵囊壁在肌胃内被破坏,孢子囊进入小肠,子孢子逸出。到达盲肠的子孢子首先进入表层上皮细胞,再通过基底膜到达固…     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫甘肃株钙调域蛋白激酶基因的克隆与表达

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从柔嫩艾美耳球虫甘肃株(E．tenella GS，Et GS)孢子化卵囊的子孢子中提取总RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原钙调域蛋白激酶(CDPK)基因。将Et GS CDPK基因与原核表达载体pGEX-6P1连接，构建了pGEX-CDPK原核表达质粒，并获得高效表达和纯化的CDPK融合蛋白，表达率达35．4％。序列分析表明：Et GS CDPK与文献报道的Et CDPK比较，共有5个核苷酸发生变异，核苷酸同源性为99．6％；有5个氨基酸发生变异，氨基酸同源性为98％。     

新疆阿拉尔某鸡场球虫种类调查

为了了解阿拉尔市某鸡场鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别采集新鲜粪便并检出阳性粪便,对检出的阳性粪便采用饱和盐水漂浮法和离心沉淀法进行卵囊分离;显微镜下观察卵囊、最短孢子化时间、最小潜在期和病理变化,进行虫种鉴定。最后得出该鸡场感染有堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）、巨型艾美耳球虫（E．maxima）和柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）,该鸡场球虫感染严重,且为混合感染。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因表达产物的初步免疫效果研究

用柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella子孢子表面抗原基因原核细胞表达产物免疫雏鸡,观察其对球虫攻击的免疫保护作用.将可溶性重组蛋白和包涵体重组蛋白经肌肉注射分别于7日龄、14日龄两次免疫罗曼小公雏,同时设攻虫对照组和空白对照组,于第2次免疫后1周(28日龄)用1 ×104个E.tenella卵囊进行攻毒,观察其诱导产生的保护力.结果表明,3-1E可溶性蛋白组免疫无论从卵囊计数、盲肠病变计分和相对增重均优于包涵体免疫组.说明3-1E基因在大肠杆菌中的表达产物对鸡柔嫩艾美耳球虫的攻击有一定的免疫保护作用.     

鸡柔嫩艾美耳球虫生殖细胞特异性蛋白的免疫保护效果评价

为探讨鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)生殖细胞特异性蛋白(HAP2)对球虫感染的免疫保护作用,将HAP2重组蛋白(rEtHAP2)加弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂免疫雏鸡后,用E. tenella孢子化卵囊感染雏鸡,以雏鸡增重效果、卵囊排出量、肠道病变记分、血清抗体水平、淋巴细胞转化水平,评估rEtHAP2的免疫保护作用,并设PBS免疫对照组、正常饲养对照组。结果显示:rEtHAP2免疫组雏鸡的平均体重、日增重、血清抗体水平、淋巴细胞转化水平,均显著高于PBS免疫对照组(P0.05);卵囊排出量,肠道病变记分则显著低于PBS免疫对照组(P0.05);抗球虫指数ACI值为176.18,保护效果良好。研究表明生殖细胞特异性蛋白HAP2对柔嫩艾美耳球虫感染具有良好的免疫保护作用,可成为柔嫩艾美耳球虫新型疫苗的候选抗原。     

鸡球虫体外HCT-8细胞培养模型的建立

由柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)引起的球虫病严重损害鸡的肠道健康,给养鸡业造成巨大的经济损失。E.tenella寄生在鸡盲肠上皮细胞,体外培养可在鸡原代肾细胞内发育成卵囊完成内生发育过程,而在其他传代细胞系内只能完成部分生殖阶段,为了延长其在细胞内的发育进程,建立了鸡球虫HCT-8细胞培养模型。将新鲜制备的E.tenella子孢子接种HCT-8细胞,制备细胞爬片,分别进行HE染色和DAPI染色,观察子孢子在细胞内的发育状况。结果表明,子孢子在接种后6 h即可入侵HCT-8细胞,随后子孢子发育为滋养体至48 h形成第一代裂殖体,至54h第一代裂殖子释放,于72 h形成第二代裂殖体,在144 h第二代裂殖子释放出来,继续培养至168h未见到卵囊形成,而试验虫株接种鸡体后在144～168 h即可观察到大量未孢子化卵囊排出体外,据此确定子孢子在该细胞内的发育过程结束。本研究所建立的鸡球虫细胞培养模型将子孢子发育至第二代裂殖生殖阶段,将发育阶段向前推进了一个进程,为鸡球虫相关研究工作的开展提供技术平台。     

柔嫩艾美耳球虫伴侣蛋白TCP-1亚基α的特性和功能初步分析

柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。     

EtMIC-2表达产物对鸡三种艾美耳球虫的保护试验

鸡艾美耳球虫病由隶属顶复门7种艾美耳球虫（E.tenella、Enecatrix、E.acervulina、E.naxima、E.brunetti、E.praecox、E.mitis）引起，常混合感染，有很高的发病率和死亡率，轻者则影响鸡的增重和饲料转化率。微线是顶器的结构之一，位于子孢子和裂殖子前端，EtMIC-2是其50kDa左右的酸性蛋白，在虫体入侵时表达，该蛋白可能在虫体入侵时起重要作用。用Pet载体经原核表达该蛋白，7、14日龄经口服、肌注不同剂量工程活菌和菌体裂解蛋白二次免疫鸡，免疫后1周用3种艾美耳球虫（E.tenella、E.acervulina、E.maxima）攻虫，发现相对增重率随菌体蛋白含量增加呈现增加趋势。E.tenella攻虫表现最有效的是口服PBS200ug活菌组为96%，E.ac-ervulina、E.maxima分别为96%、87%。从攻虫后7～14d卵囊排出曲线看，每天排卵囊数和相对卵囊产量均低于红对照；相对卵囊产量,E.tenella攻虫后，口服PBS 200ug活菌组最低，为17%，E.acervulina、E.maxima攻虫后，口服PBS 200ug裂解菌组最高，分别为90%、93%。从增重与卵囊产量来看，EtMIC-2对E.tenella、E.ac-ervulina和E.maxima这3种球虫有一定的免疫保护作用，尤其口服200ugPBS活菌时，对E.tenella保护作用最明显。说明来源于E.tenella子孢子的Etmic-2基因的表达产物对E.tenella、E.acervulina和E.maxima3种球虫有一定的免疫保护作用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫YL株多次传代后的致病性研究

为研究多次传代后的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)YL株的致病性,分别以不同剂量的36代次柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,通过临床症状、死亡率、血便程度、潜隐期、盲肠病变、平均增重及每克粪便卵囊数(OPG)对其致病性进行评价.结果显示,不同剂量孢子化卵囊感染雏鸡均在感染后3d～4d出现血便,球...     

单味中草药对球虫卵囊体外抑制的试验研究

为了观察中草药对球虫卵囊体外孢子化抑制的影响,试验将不同浓度的常山、青蒿、白头翁等16味中草药与柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)卵囊在28℃条件下培养4~6 d,计数卵囊的孢子化率。结果表明:所选中草药均极显著抑制卵囊孢子化(P0.01),并随着药物浓度的增加,卵囊孢子化率呈下降趋势,其中以青蒿、使君子、草果、苦参等中草药的抑制效果最好。     

鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验

给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella)和/或堆形艾美耳球虫(E.acervulina)孢子化卵囊,出雏后在无球虫环境中笼养,1~10日龄每天收集各组粪便样本,计数克粪便卵囊数(OPG),并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、饲料转化率(FCR)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果显示,以E.tenella或E.acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚,其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致,有相似的排卵囊曲线,提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31.9%~51.7%提高到了76.5%~83.6%,RCR由攻虫对照组的4.11~4.89改善为2.72~2.96,ROP降至4.7%~23.5%。结果表明以一定剂量E.tenella和E.acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫E.tenella和E.acervulina卵囊组与单一接种E.tenella或E.acervulina卵囊组的免疫效果发现,混合免疫组的各项指标均稍优于后者。     

柔嫩艾美耳球虫延伸因子1α特性与功能初步分析

鸡球虫病在世界范围内对家禽业具有重大的经济影响，导致高死亡率、低增长、低生产力和高防治成本。由于球虫耐药性问题严峻，球虫病的防治重点倾向于研究方便安全，并且与活疫苗相比更容易生产的亚单位疫苗。因此，迫切需要新的方法来有效地控制球虫病，包括寻找特定的分子靶标。本文以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA第一链为模板，扩增了延伸因子1α（EtEF1α）的ORF序列，生物信息学分析显示，该基因编码450个氨基酸，预测相对分子质量为49.1 ku，等电点为4.7；编码的蛋白无信号肽和跨膜结构域，但都含有N-肉豆蔻酰化位点。qRT-PCR和Western blot分析EtEF1α在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平和蛋白翻译水平，结果显示，EtEF1α在子孢子（Spz）和裂殖子（Mrz）的mRNA转录水平高于未孢子化卵囊（UO）和孢子化卵囊（SO），翻译水平在UO和Mrz高表达；间接免疫定位发现，EtEF1α主要定位于Spz一端和整个Mrz，随着虫体在细胞内发育，荧光强度逐渐增强。分泌试验显示该蛋白为分泌蛋白，但不是由微线体分泌的。入侵抑制试验结果表明，兔抗rEtEF1α多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞，抑制率约为22%。综上表明，该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育和子孢子入侵宿主细胞的过程。