柔嫩艾美耳球虫含HD结构域蛋白特性和功能初步研究

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株与敏感株基因组SNP杂合度的比较分析

鸡球虫病是阻碍养禽业健康发展的重要寄生虫病。地克珠利作为一种低毒、广谱、高效的抗球虫药物得到了广泛使用,但长期使用导致鸡球虫耐药株广泛出现。为了探究鸡球虫对地克珠利产生耐药性的分子机制,本试验采用药物浓度递增的方法诱导耐药株,通过全基因组重测序分析柔嫩艾美耳球虫耐药株和敏感株之间单核苷酸多态性(SNP)的杂合度差异。结果显示,与敏感株相比,耐药株在蛋白激酶(EVM0000192)基因存在2个非同义突变,推测其与柔嫩艾美耳球虫的地克珠利耐药性的产生有关,本试验为后续利用更多耐药株的SNP来发掘地克珠利耐药基因提供了科学依据。     

基于SNP密度分布分析柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药虫株与敏感虫株的差异

为明确地克珠利耐药虫株与敏感虫株在基因水平的差异,进而解析地克珠利耐药性产生的分子机制,本研究以实验室保存的2株柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药虫株和2株柔嫩艾美耳球虫地克珠利敏感虫株为研究对象,将4个虫株进行全基因组重测序(NGS),通过单核苷酸多态性(SNP)密度分布解析耐药株与敏感株之间的差异。结果显示,与敏感株相比,耐药株在第13号染色体0.1～1 Mb区间内的SNP比较富集。本研究结果为解析鸡球虫14条染色体上抗原变异位点和耐药性位点等的研究提供了科学依据。     

安徽3个地区柔嫩艾美耳球虫对6种药物的抗药性

目的检测三株柔嫩艾美耳球虫对六种药物的耐药性,为防治球虫病制定临床用药方案提供依据。方法鸡体实验法检测巢湖、六安、肥东三株柔嫩艾美耳球虫对马杜拉霉素、盐霉素、莫能菌素、磺胺喹嗯啉钠、地克珠利、妥曲珠利的耐药性,以抗球虫指数（ACI）、病变记分减少率（RLS）、相对盲肠卵囊产量（ROP）和最适抗球虫活性百分率（POAA）四项指标综合判定。结果巢湖株对地克珠利,盐霉素与莫能菌素轻度耐药,对马杜拉霉素中度耐药,对托曲株利和磺胺喹嗯啉钠重度耐药,六安株对地克株利与托曲株利重度耐药,对磺胺喹嗯啉钠中度耐药,对盐霉素轻度耐药,对马杜霉素敏感,肥东株对磺胺喹嗯啉钠完全耐药,对莫能菌素重度耐药,对马杜霉素与盐霉素轻度耐药,对地克珠利与托曲珠利中度耐药。结论3个地区的柔嫩艾美耳球虫对供试药物已产生不同程度的耐药性。     

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利敏感性试验

进行了3个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(吉林株、山东株、黑龙江株)对地克珠利饮水剂的敏感性试验.分别给予试验组鸡1×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊,感染后饮水给予地克珠利药物治疗.结果表明,3株球虫的敏感性不同,其敏感顺序为:山东株＞黑龙江株＞吉林株.由此可见,柔嫩艾美耳球虫不同地理株间存在对地克珠利的敏感性差异.     

柔嫩艾美耳球虫2个抗药株的抗药性评估

为检测实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量4项指标,评价2个抗药株对地克珠利、癸氧喹酯、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的抗药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,柔嫩艾美耳球虫敏感株对3种抗球虫药物均无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性;对地克珠利、癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株对地克珠利表现为完全耐药,4项指标全部阳性;对马杜拉霉素表现为中度耐药,2项指标阳性;对癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个抗药虫株对其诱导药物具有明显抗药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫抗药性机制等相关研究奠定了基础。     

表达黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的转基因柔嫩艾美耳球虫的发育和致病性分析

为了研究外源基因表达对转基因柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)生物学特性的影响,对转基因球虫(TE1)和BJ株(野生强毒)的发育和致病性进行比较分析.结果显示,相对于BJ株,转基因球虫TE1株繁殖力下降约4倍,低剂量感染时致病性下降明显,但是高剂量感染时依然保持较强的致病性.另外,在荧光显微镜下发现,TE1有滋养体、第一代裂殖体/裂殖子、第二代裂殖体/裂殖子和大小配子体等内生发育虫体.孢子化卵囊内4个孢子囊并非全部表达黄色荧光蛋白.这些结果说明黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的表达在一定程度上降低了转基因柔嫩艾美耳球虫致病性和繁殖力.在柔嫩艾美耳球虫合子减数分裂过程中,存在同源或异源染色体重组现象.     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。     

首个国产鸡球虫疫苗问世保护率超95％

佛山市正典生物技术有限公司自主研发的“鸡球虫病四价活疫苗（柔嫩艾美耳球虫PTMZ株＋毒害艾美耳球虫PNHZ株＋巨型艾美耳球虫PMHY株＋堆型艾美耳球虫PAHY株）”近日获得国家三类新兽药证书，这是国内首个全部采用早熟选育致弱的药物敏感虫株组成的鸡球虫病四价活疫苗。     

柔嫩艾美耳球虫配子体基因Etgam56的克隆表达与鉴定

提取柔嫩艾美耳球虫(扬州株)配子体基因组DNA,PCR扩增配子体基因Etgam56,经克隆和序列分析后,优化密码子,连接至pET-28a(+),构建原核表达载体pET-28a(+)-Etgam56,优化条件进行体外诱导表达,Western blot分析其抗原性。结果显示,Etgam56基因全长1 425 bp,为一个完整开放阅读框,共编码474个氨基酸;体外表达重组蛋白的大小约为56 ku,IPTG终浓度为0.10 mmol/L,37℃诱导3 h时的表达量最高,且主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、柔嫩艾美耳球虫鸡康复血清和毒害艾美耳球虫鸡康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。本研究将为进一步探析柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫基因工程疫苗奠定基础。     

柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的mRNA差异显示

利用柔嫩艾美耳球虫马杜霉素敏感虫株裂殖子和抗药虫株裂殖子为材料,对马杜霉素敏感虫株和抗药虫株进行差异显示PCR,共回收34条电泳差异片段,反向Northern点杂交鉴定4个片段为真正差异片段,并对4个片段进行测序、B1ast同源性比较.来自于马杜霉素抗药虫株裂殖子的ACD3-2序列与柔嫩艾美耳球虫微线-5同源性99%,说明AcD3-2序列是该基因的部分序列,微线-5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关,在第二代裂殖子时期,抗药性虫株该序列发生转录,而在敏感虫株中沉默;HCD1序列来自马杜霉素敏感虫株,与柔嫩艾美耳球虫表面抗原16和17序列同源性分别为83%和86%,说明与这2个基因同源.AGD5片段来自抗药虫株,HAD8-2序列来自敏感虫株,通过比较这2条序列可能为新序列.     

柔嫩艾美耳球虫HMGB1基因的克隆与原核表达

高迁移率族蛋白是细胞"警报素"的一员,具有多样的生物学效应。本研究利用生物信息学技术从柔嫩艾美耳球虫转录组中鉴定到Et HMGB1基因序列,根据获得的基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊总RNA为模板,通过RT-PCR技术获得Et HMGB1基因,并构建p ET28a-Et HMGB1重组表达载体,进行原核表达。结果显示,Et HMGB1基因全长为432 bp,编码1段全长为143个氨基酸的多肽,该融合蛋白分子质量约为16 000,与预期分子质量一致。Et HMGB1基因的成功克隆和表达为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) SO7重组酵母蛋白的表达及其免疫保护效果,试验用E.tenella的保护性抗原基因SO7与鸡IL-2基因串联在毕赤酵母表达载体pPICZαA中进行表达,用Western-blot检测表达是否成功。分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并以1×10~4个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫,观察免疫保护效果。结果表明:诱导后的重组酵母全菌蛋白pPICZαA-SO7-IL2成功表达;两种蛋白抗球虫指数(ACI)分别为175.48,174.35,说明pPICZαA-SO7-IL2对感染鸡只具有较高的抗球虫效果。     

柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达

为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫沈阳分离株Mic2基因的克隆及序列分析

<正>随着分子生物学技术的快速发展,国内外均已经克隆出了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白2(Mic2)基因[1-2]。为了进一步明确沈阳地区分离株柔嫩艾美耳球虫Mic2基因与其他地区分离株Et Mic2基因之间的序列相似性,本试验从沈阳地区分离到的柔嫩艾美耳球虫中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出Et Mic2基因,将其插入克隆载体p EASY-T1,对Mic2     

柔嫩艾美耳球虫田间分离株药物耐药性调查

作者采集了5个不同地区发生球虫病鸡场的粪便,分离柔嫩艾美耳球虫不同地理株,为了检测它们对药物敏感性,选择常用的预防球虫病药物马杜拉霉素、莫能菌素、地克珠利,以ACI作为指标,进行了的药物敏感试验。结果表明,北京-1、潍坊和上海株对饲料中添加5 mg/kg马杜拉霉素产生了部分耐药性,而北京-2和北京-3两个虫株对其则敏感;北京-1、北京-2和潍坊株对100 mg/kg莫能菌素部分耐药,上海株完全耐药,而北京-3株对其敏感;北京-1、北京-2、潍坊株和上海株对1.0 mg/L地克珠利产生了部分耐药性,而北京-3株对它敏感。