柔嫩艾美耳球虫伴侣蛋白TCP-1亚基α的特性和功能初步分析

柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。     

柔嫩艾美耳球虫延伸因子1α特性与功能初步分析

鸡球虫病在世界范围内对家禽业具有重大的经济影响，导致高死亡率、低增长、低生产力和高防治成本。由于球虫耐药性问题严峻，球虫病的防治重点倾向于研究方便安全，并且与活疫苗相比更容易生产的亚单位疫苗。因此，迫切需要新的方法来有效地控制球虫病，包括寻找特定的分子靶标。本文以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA第一链为模板，扩增了延伸因子1α（EtEF1α）的ORF序列，生物信息学分析显示，该基因编码450个氨基酸，预测相对分子质量为49.1 ku，等电点为4.7；编码的蛋白无信号肽和跨膜结构域，但都含有N-肉豆蔻酰化位点。qRT-PCR和Western blot分析EtEF1α在虫体不同发育阶段的mRNA转录水平和蛋白翻译水平，结果显示，EtEF1α在子孢子（Spz）和裂殖子（Mrz）的mRNA转录水平高于未孢子化卵囊（UO）和孢子化卵囊（SO），翻译水平在UO和Mrz高表达；间接免疫定位发现，EtEF1α主要定位于Spz一端和整个Mrz，随着虫体在细胞内发育，荧光强度逐渐增强。分泌试验显示该蛋白为分泌蛋白，但不是由微线体分泌的。入侵抑制试验结果表明，兔抗rEtEF1α多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞，抑制率约为22%。综上表明，该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育和子孢子入侵宿主细胞的过程。     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

柔嫩艾美耳球虫2个抗药株的抗药性评估

为检测实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量4项指标,评价2个抗药株对地克珠利、癸氧喹酯、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的抗药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,柔嫩艾美耳球虫敏感株对3种抗球虫药物均无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性;对地克珠利、癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株对地克珠利表现为完全耐药,4项指标全部阳性;对马杜拉霉素表现为中度耐药,2项指标阳性;对癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个抗药虫株对其诱导药物具有明显抗药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫抗药性机制等相关研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶2A基因的克隆表达及转录动态分析

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)组蛋白去乙酰化酶2A(Et Sir2A)的生化功能及其对生活史发育的潜在调节作用,以柔嫩艾美耳球虫甘肃株为例,检测其在不同发育阶段表达量的差异。以基因组数据预测的编码序列为模板设计引物,采用RT-PCR的方法扩增得到Et Sir2A的全长ORF,构建p MAL-C2X-Et Sir2A重组表达质粒并进行原核表达;提取未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段/时期的总RNA,采用qRT-PCR方法检测Et Sir2A的转录动态变化。测序结果显示,克隆的Et Sir2A ORF序列全长909 bp,编码302个氨基酸,并能在大肠杆菌原核系统中成功表达;qRT-PCR结果显示,Et Sir2A在不同发育阶段mRNA转录水平差异显著,在未孢子化卵囊阶段最高,第二代裂殖子阶段最低。结果为进一步研究Et Sir2A功能和开发新型抗球虫药物提供了数据基础。     

表达黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的转基因柔嫩艾美耳球虫的发育和致病性分析

为了研究外源基因表达对转基因柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)生物学特性的影响,对转基因球虫(TE1)和BJ株(野生强毒)的发育和致病性进行比较分析.结果显示,相对于BJ株,转基因球虫TE1株繁殖力下降约4倍,低剂量感染时致病性下降明显,但是高剂量感染时依然保持较强的致病性.另外,在荧光显微镜下发现,TE1有滋养体、第一代裂殖体/裂殖子、第二代裂殖体/裂殖子和大小配子体等内生发育虫体.孢子化卵囊内4个孢子囊并非全部表达黄色荧光蛋白.这些结果说明黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的表达在一定程度上降低了转基因柔嫩艾美耳球虫致病性和繁殖力.在柔嫩艾美耳球虫合子减数分裂过程中,存在同源或异源染色体重组现象.     

安徽3个地区柔嫩艾美耳球虫对6种药物的抗药性

目的检测三株柔嫩艾美耳球虫对六种药物的耐药性,为防治球虫病制定临床用药方案提供依据。方法鸡体实验法检测巢湖、六安、肥东三株柔嫩艾美耳球虫对马杜拉霉素、盐霉素、莫能菌素、磺胺喹嗯啉钠、地克珠利、妥曲珠利的耐药性,以抗球虫指数（ACI）、病变记分减少率（RLS）、相对盲肠卵囊产量（ROP）和最适抗球虫活性百分率（POAA）四项指标综合判定。结果巢湖株对地克珠利,盐霉素与莫能菌素轻度耐药,对马杜拉霉素中度耐药,对托曲株利和磺胺喹嗯啉钠重度耐药,六安株对地克株利与托曲株利重度耐药,对磺胺喹嗯啉钠中度耐药,对盐霉素轻度耐药,对马杜霉素敏感,肥东株对磺胺喹嗯啉钠完全耐药,对莫能菌素重度耐药,对马杜霉素与盐霉素轻度耐药,对地克珠利与托曲珠利中度耐药。结论3个地区的柔嫩艾美耳球虫对供试药物已产生不同程度的耐药性。     

柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导

为了研究耐药性柔嫩艾美耳球虫产生耐药性的机理,本研究在实验室条件下,采用药物浓度递增的方法,以15 mg/kg为起始诱导浓度,对柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药性进行诱导。经过10次传代,获得了对60 mg/kg盐霉素耐药的柔嫩艾美耳球虫虫株。以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量四项指标综合判定柔嫩艾美耳球虫对盐霉素的耐药性。其中抗球虫指数为156.92,最适抗球虫活性百分率为32.38,病变记分减少率为53.85,相对卵囊产量为28.17。结果显示,成功获得了柔嫩艾美耳球虫对盐霉素完全耐药的虫株,为进一步从分子水平研究球虫抗药性奠定基础。     

西藏那曲市羊源大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究

为了解西藏那曲市羊大肠杆菌的耐药情况，指导临床进行合理用药，本试验从那曲市采集羊新鲜无污染腹泻物92份，进行大肠杆菌显色培养基分离、革兰氏染色镜检、生化鉴定、分子生物学鉴定、致泻性大肠杆菌生化鉴定、药敏试验及耐药基因检测。结果显示，分离菌株在大肠杆菌显色培养基上呈蓝色菌落、革兰氏染色为粉红色的短杆菌，通过生化鉴定及23S rRNA的PCR检测得到26株羊源大肠杆菌，分离率为28.3%；其中25株符合致泻性大肠杆菌生化特性，致泻菌株分离率为27.2%。药敏试验结果显示，所得25株羊源大肠杆菌对氨苄西林的耐药性较高，耐药率为24.0%；对羧苄西林、卡那霉素的耐药性次之，耐药率为8%；对哌拉西林、头孢呋辛、庆大霉素、四环素、米诺霉素等药物耐药率为4%；对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等药物极为敏感，可作为临床用药。5种耐药基因检测结果显示，bla_TEM基因检出率为100%，表明分离菌均含有相应的耐药基因。以上结果表明，西藏那曲市羊源大肠杆菌对多种药物耐药，提示在临床实践过程中应注重合理用药、联合用药，减缓大肠杆菌耐药性的产生。     

Flock-level prevalence of Eimeria species among broiler chicks in northern Jordan

Six chicks (3–6 weeks of age) were taken randomly from each of 200 broiler farms in northern Jordan, these chicks were submitted for post-mortem and parasitological examinations. Seven Eimeria spp. were identified: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. necatrix, E. mivati, E. mitis, and E. tenella. Half (50%) of the farms surveyed had all six chicks infected, 23% of the farms were free of the infection. E. tenella was the most prevalent species (39%) followed by E. necatrix (12%), E. brunitti (12%), and E. maxima (10%). Prevalences did not vary by flock size. Also, neither the use of coccidiostat nor previous coccidiosis clinical outbreaks was associated with the prevalence of coccidiosis.     

猪源大肠杆菌O157:H7体外氟苯尼考耐药诱导及对抗菌药物敏感性变化研究

为初步研究猪源大肠杆菌O157:H7 (E.coli O157:H7)对氟苯尼考耐药性的产生和消除机制,本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将两株猪源大肠杆菌O157:H7诱导成氟苯尼考高度耐药菌株,采用无氟苯尼考压力下连续传代培养的方法将获得的氟苯尼考耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,检测耐药诱导菌和耐药消除菌对抗菌药物的敏感性,并检测菌株质粒携带的耐药基因。结果显示,经氟苯尼考耐药诱导,猪源大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定和头孢噻吩由敏感变为耐药,对头孢噻肟的敏感性由敏感变为中介,对氧氟沙星、环丙沙星和阿奇霉素由中介变为耐药;而经耐药消除后,菌株恢复对上述药物的敏感性;在菌株的质粒中检测到氟苯尼考耐药基因、喹诺酮类耐药基因和β-内酰胺酶基因,与耐药表型相符。结果表明,在氟苯尼考压力的长期存在下,猪源大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考产生耐药,且对青霉素类、头孢类和喹诺酮类药物产生交叉耐药,在去除氟苯尼考压力下连续培养,可消除菌株的部分耐药性。     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

Development and validation of an ELISA for detecting antibodies to Eimeria tenella in chickens

The aim of this study was to develop and validate an ELISA for detecting chicken antibodies to Eimeria tenella. An initial comparison of merozoite and sporozoite antigen preparations revealed few differences in their ability to monitor the onset, kinetics and magnitude of the antibody response suggesting that both antigens would be equally useful for development of an ELISA. Furthermore the cross-reactivity of these antigens with sera from birds infected with chicken Eimeria species was similar. The merozoite antigen was selected for further evaluation because it was easier to prepare. Discrimination between sera from birds experimentally infected with E. tenella and birds maintained in an Eimeria-free isolation facility was excellent. In sera collected from free-range layers and commercial broilers there also appeared to be clear discrimination between infected and uninfected birds. The ELISA should prove useful for monitoring infectivity in vaccination programmes in layer and breeder flocks and for assessing the effectiveness of biosecurity measures in broiler flocks.     

甘肃省部分地区兔艾美耳球虫分子流行病学调查研究

为调查甘肃省兔艾美耳球虫的感染状况、虫种分布和风险因素,本研究从甘肃省平凉、酒泉、武威地区采集5个不同品种兔的592份粪便样品,提取粪便样品中的基因组DNA,基于艾美耳球虫核糖体第1内转录间隔区（ITS1）设计引物,采用特异性PCR扩增兔艾美耳球虫基因片段。结果发现,兔艾美耳球虫的总感染率为50%（296/592）;通过序列比对分析共鉴定出7种不同的兔艾美耳球虫,分别是大型艾美耳球虫（24.5%,145/592）、肠艾美耳球虫（4.1%,24/592）、中型艾美耳球虫（11.5%,68/592）、穿孔艾美耳球虫（19.8%,117/592）、维氏艾美耳球虫（24.5%,145/592）、小型艾美耳球虫（4.9%,29/592）和盲肠艾美耳球虫（0.84%,5/592）;以大型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫为优势虫种,同时发现所调查的兔中有多重感染的情况,最多包括四重感染。统计学分析显示,地区因素（P<0.05）、品种因素（P<0.05）和年龄因素（P<0.05）是影响兔艾美耳球虫感染率的风险因素,提示应该针对这3种因素采取有效的防控措施。本研究结果揭示了甘肃省部分地区养殖场兔的艾美耳球虫感染率、虫种分布和感染率的风险因素,为预防和控制甘肃省地区养殖兔的艾美耳球虫病提供了科学依据。     

Study on Drug Resistance of Escherichia coli Isolated from Chicken and Swine in Organic Farm

To determine the drug resistance of E.coli strains from swine and chicken in organic farm,collection of stool specimens was conducted in one organic farm in Conghua city,Guangdong province in 2014,in which 118 E.coli strains were separated,including 55 from chicken and 63 from swine.The sensitivity of the E.coli strains from swine and chicken to 18 kinds of drugs was detected through agar dilution method.Similar properties in drug resistance were observed both in E.coli strains from swine and chicken in the same organic farm.In consideration of the resistance rate,samples were relatively sensitive to ceftazidime,cefquinome,cefoxitin,amikacin,apramycin,gentamicin,neomycin,florfenicol,chloramphenicol,imipenem,ciprofloxacin and olaquindox (chicken 0 to 21.8%;swine 0 to 14.3%).These isolates showed moderate resistance to ampicillin and streptomycin (chicken 29.1% to 38.2%;swine 23.8% to 27.0%).About 56.4% chicken isolates and 47.6% swine isolates showed resistant to more than 3 kinds of drugs.However,severe resistance was observed in trimethoprim-sulphamethoxazole,tetracyclineand and doxycycline (chicken 45.5%,76.4% and 72.7%;swine 50.8%,81.0% and 68.3%).The results also indicated that under organic farming mode,the drug resistance rates of E.coli strains from swine and chicken were relatively low in general.Multi-drug resistance existed but was relatively slight.Although the drug resistance rate to several specific antimicrobials was high,it was still lower than that in conventional farms.Since most studies focused on the drug resistance of the bacteria under conventional farming model,this study filled the blank of the research of drug resistance under organic farming model.     

有机农场鸡、猪源大肠杆菌耐药性研究

为了解有机养殖模式下鸡、猪源大肠杆菌的耐药情况,2014年从广东从化某有机农场鸡、猪粪便中采集并分离出118株大肠杆菌,包括55株鸡源大肠杆菌和63株猪源大肠杆菌,采用琼脂稀释法测定大肠杆菌对18种抗菌药的敏感性。结果发现,同一有机农场中,鸡源大肠杆菌与猪源大肠杆菌在耐药种类及耐药率上均呈现相似规律,对头孢他啶、头孢喹肟、头孢噻肟、头孢西丁、阿米卡星、安普霉素、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、氯霉素、亚胺培南、环丙沙星、喹乙醇等较敏感(鸡0~21.8%,猪0~14.3%),对氨苄西林、链霉素呈现轻度耐药(鸡29.1%~38.2%,猪23.8%~27.0%),对复方新诺明、四环素、多西环素呈现较严重耐药(鸡45.5%、76.4%和72.7%,猪50.8%、81.0%和68.3%)。鸡源大肠杆菌中3耐及3耐以上的菌株占56.4%,猪源大肠杆菌占47.6%。结果表明有机养殖模式下鸡、猪源大肠杆菌耐药率相对较低,多重耐药现象存在但相对轻微,对个别临床常用抗菌药耐药率虽较严重但比常规养殖场低。由于目前国内大部分学者致力于研究常规养殖方式下细菌耐药情况,本研究很好地填补了有机养殖模式下畜禽大肠杆菌耐药性研究的空白。