传染性腔上囊炎疫苗免疫鸡TLR7基因表达的动态变化

给11日龄雏鸡分别口服接种鸡传染性腔上囊炎（IBD）弱毒疫苗（法贝灵，IBD-Blen）1和3头份后，于不同时间采集脾和腔上囊组织，分离纯化淋巴细胞，常规方法抽提总RNA，以鸡伊actin基因为内参，采用半定量RT—PCR法检测两种组织中鸡Toll样受体7（ChTLR7）基因的表达动态。结果显示，接种IBD弱毒疫苗前，试验鸡脾和腔上囊组织中均有ChTLR7的微量表达，疫苗接种后第7h，脾中ChTLR7 mRNA的表达开始显著上调，至接种后第12h达峰值，此后迅速下降，至第130h时降至疫苗接种前的水平；而腔上囊组织中ChTLR7 mRNA的表达自接种后第12h开始增加，第24h时达峰值，随后迅速下降，约72h后恢复至疫苗接种前水平。表明ChTLR7可能参与了IBDV感染早期的天然免疫反应过程。     

鸭疫里默氏杆菌抗体检测的全菌体抗原间接ELISA方法的建立

本研究建立了检测鸭疫里默氏杆菌（Rimerrlla anatipestifer,RA）抗体的全菌体抗原间接ELISA方法,最佳血清稀释倍数为1：100。以RA1的甲醛灭活全菌体为包被抗原,棋盘滴定法试验确定其最适抗原包被浓度为5×10^8CFU／mL。与全菌体裂解抗原和重组P25蛋白为包被抗原的间接ELISA方法相比较,三者均可检测不同血清型RA标准阳性血清,结果符合性良好。用该方法检测雏鸭接种鸭疫里默氏杆菌蜂胶灭活疫苗后血清抗体水平的变化,发现免疫后10天抗体水平开始上升,二免后10天抗体水平达到峰值。     

鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用

本研究从鸭疫里默氏菌提取基因组DNA,采用细菌16S rRNA基因的通用引物,用PCR方法成功扩增出鸭疫里默氏菌的部分16S rRNA基因,克隆及测序结果表明其全长1512bp,G＋C含量为51％,该序列已登人GenBank,登录号为DQ078779。同时利用生物软件对GenBank收录的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的16S rRNA基因序列进行分析后,设计了鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的种特异性引物,分别能从各自的16S rRNA基因中扩增出长度为342和718bp的DNA片段。并据此建立了一种能快速准确鉴别诊断鸭疫里默氏菌和大肠杆菌病的双重PCR方法,该方法能从肝脏组织悬液煮沸后的上清、细菌培养物或提取的细菌基因组DNA中快速扩增出相应的片段,进行鉴别诊断。     

顶复门原虫电子转移链代谢及Ⅱ型NADH脱氢酶研究进展

顶复门原虫是包括刚地弓形虫、疟原虫及球虫等在内的一大类寄生性原虫的总称,可引起重要的人畜寄生虫病.抗顶复门原虫药物的长期使用,甚至是滥用,使得这类寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物.Ⅱ型NAD(P)H脱氢酶是电子转移链途径中的关键酶,由于其仅存在于某些植物、细菌、真菌和寄生原虫等一些低等生物体内,而在高等动物体内缺失,是研发新型抗感染性药物的重要靶标.笔者主要针对顶复门原虫线粒体电子转移链代谢途径以及Ⅱ型NAD(P)H脱氢酶的研究概况进行综述.     

新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用

利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，对各项条件进行优化，确定判定标准，建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。经对多例血清检测表明，所建立的诊断试剂盒重复性好、特异性强、灵敏度高，与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较，符合率均达到92％以上。应用建立的ELISA方法对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测，阳性率为22％。这是国内首次利用重组蛋白建立的诊断试剂盒，该方法的建立将为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

鸭源大肠杆菌O_(78)菌蜕的制备及免疫原性研究

为制备大肠杆菌(E.coli)菌蜕并研究其免疫原性,本研究将带有裂解基因E的质粒pHH43转化致病性鸭源E.coli O78,构建获得E.coli O78/pHH43重组菌。于不同培养温度下研究重组菌E裂解蛋白表达所介导的宿主菌的裂解情况,结果显示在42℃培养时最佳诱导时间为4h,约90%的重组菌被裂解失活,以冻干法及添加庆大霉素完全灭活未裂解的细菌后制备"菌蜕疫苗"。雏鸭免疫试验表明,接种E.coli O78/pHH43菌蜕两周后免疫雏鸭可产生对同源强毒菌株致死剂量攻击的免疫保护。比较E.coli O78/pHH43菌蜕与甲醛灭活的同株E.coli所诱导的免疫保护效果,结果免疫保护率分别为87.5%和75%,表明菌蜕比甲醛灭活法能更有效地诱导机体的特异性免疫应答。     

顶复门原虫入侵相关因子的研究进展

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫,包括弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、疟原虫(Plasmodium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)及艾美耳球虫(Eimeria spp.)等,是人和动物的重要病原.这类原虫具有相似的亚细胞结构和保守的入侵机制.研究结果表明,入侵过程是由大量的入侵相关蛋白分子所介导的,包括微线、棒状体及致密颗粒所分泌的相关蛋白等.随着生物信息学及分子生物学的发展,顶复门原虫入侵相关蛋白分子的研究资料也日益增多.笔者结合最近几年本课题组的研究成果,综述了顶复门原虫入侵相关蛋白因子的最新进展.     

鸡B淋巴细胞激活因子(ChBAFF)基因的克隆表达

根据GenBank中收录的鸡B淋巴细胞激活因子(chicken B cell activator factor,ChBAFF)基因序列,设计特异引物,以3周龄鸡法氏囊总PNA为模板,经RT-PCR扩增出ChBAFF的ORF序列,测序后,插入质粒pMAL-c2X,构建重组表达载体,转染到大肠杆菌Rosset(DE3),并以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25%,融合蛋白的分子量约为75 ku,所表达重组蛋白主要存在于菌体裂解物上清液中,为可溶性表达.以淀粉树脂柱亲和层析纯化重组蛋白后进行SDS-PAGE,用BandScan软件分析,提纯重组蛋白的含量可达97.5%.MTT比色法分析证明,纯化的重组蛋白可显著刺激鸡脾脏淋巴细胞的活化.     

柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白70(Et HSP70)的重组表达及免疫保护效果

本研究初步评价了柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白70(EtHSP70)的免疫保护效果。以RT-PCR方法克隆获得E.tenella广东株的Ethsp70基因序列,插入表达载体pMAL-c2X后转化入大肠杆菌Rosetta株,经IPTG诱导,可高效表达分子量为112 ku的可溶性融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的27%。将Ethsp70基因插入真核载体pcDNA6,构建真核表达质粒pcDNA-Ethsp70。用纯化的重组融合蛋白(rEtHSP70)和pcDNA6-Ethsp70质粒分别以100μg/只剂量肌注免疫雏鸡,攻虫后以盲肠病变计分、相对盲肠卵囊产量(ROP)、相对增重率和抗球虫指数(ACI)为评价指标,结果表明2个免疫组相对盲肠卵囊产量分别为39.4%、45.2%,抗球虫指数由89分别提高至免疫组的164和150。提示EtHSP70可能是一种有潜在应用价值的保护性抗原。     

新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达

本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础.