柔嫩艾美耳球虫含HD结构域蛋白特性和功能初步研究

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫伴侣蛋白TCP-1亚基α的特性和功能初步分析

柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。     

鸡球虫入侵相关分子的研究进展

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害极其严重的寄生虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失.艾美耳球虫属于顶复器门原虫,在入侵宿主细胞过程中需要通过入侵虫体顶端的顶复器分泌蛋白发挥作用.目前已报道与鸡球虫入侵相关的重要蛋白,包括微线蛋白、蛋白激酶、热激蛋白以及糖酵解酶等.这些蛋白主要参与了鸡球虫入侵宿主细胞以及在宿主细胞内的生长发育、参与了虫体的细胞周期活动以及参与了糖酵解提供虫体入侵需要的能量等,进一步对这些分子进行研究,对了解鸡球虫入侵宿主细胞的相关机理及发展抗球虫病疫苗和治疗药物将有积极的意义.     

球虫病对兔的危害与防治

1 兔球虫病原种类简介 兔球虫病的病原体据记载有17种之多。危害最大的是斯氏艾美耳球虫（E．stiedai）,寄生于肝脏胆管上皮细胞内,其次为大型艾美耳球虫（E．reagan）、梨形艾美耳球虫（E．piriformis）,肠艾美耳球虫（E．flauescens）,均寄生于肠上皮细胞内。绝大多数种类的球虫发育分三个阶段,裂体增殖、配子生殖和孢子生殖,各阶段虫体并不相同。在粪便中的球虫称作卵囊。卵囊为椭圆形或圆形,镜下呈黄色或无色,有两层轮廓的卵囊壁,卵囊在外界一定条件下发育成熟,而且具有侵袭性。     

动物球虫病的诊治

正球虫的功能性单位是孢子,一种能动的呈香蕉形或雪茄形的细胞,顶端尖后端圆。球虫靠孢子在宿主体内移动并侵入上皮细胞内,并且子孢子代表着球虫每个生活史的起点和终点。与生活史中特殊阶段的关系由前缀来表示。子孢子是在孢子化卵囊中出现的感染形态。大小配子体融合后形成卵囊,卵囊减数分裂形成子孢子。子孢子侵入宿主细胞后通过一种复分裂即裂殖生殖形成许多裂殖子,速殖子分裂快,慢殖子分裂慢,如此等等。     

畜禽弓形虫病的防治

正刚地弓形虫是家猫和其他猫科动物的一种肠道球虫。猫是唯一的终末宿主(在其体内形成大配子和小配子),因此只有感染猫才能随粪便排出卵囊。卵囊很小,包含一个母孢子,随粪便排出时无感染力。可在1~5d内完全孢子化。完全孢子化的卵囊几乎对所有的恒温动物有感染性,恒温动物可作为刚地弓形虫的转续宿主。所谓转续宿主是指虫体在其体内可以生长或繁殖,但不能完成生活史的一种宿主。1致病机理孢子化卵囊被宿主采食后,在肠道中破裂并释放出子孢     

夏秋季肉鸡球虫病多发的原因与对策

1球虫病多发的原因 1．1温度、湿度合适 鸡感染球虫后，球虫在肉鸡消化道内经过一段时间的多次裂殖生殖，所产生的裂殖子进行配子生殖，最后形成卵囊，随粪便排出体外。球虫卵囊本无感染性，但在一定的条件下（温度8℃～35℃，最适为22℃～30℃；湿度60％～75％；充足氧气等）完成孢子生殖，就形成了具有感染力的孢子化卵囊。这种卵囊一旦被鸡大量食入，就会造成球虫病发作。而夏秋季节，温度、湿度合适，正有利于球虫的繁殖。所以，夏秋季是肉鸡球虫的多发季节。     

影响球虫病防治效果的各种因素

影响球虫病防治效果的因素主要包括： 1环境因素与饲养方式 　　1.1环境温、湿度 　　球虫病病鸡肠道中产生的卵囊随粪便排到外界环境中，这种内含原生质团的新鲜卵囊称为未孢子化卵囊，它是没有致病力的。当外界环境温度在 25～ 32° C（最适宜温度为 29° C左右）、相对湿度为 70％以上，又有充足的氧气时，未孢子化卵囊即可正常发育为孢子化卵囊。艾美耳属球虫孢子化卵囊中含 4个孢子，每个孢子内含 2个子孢子，即共有 8个子孢子。只有孢子化卵囊才具有侵袭力。我国南方梅雨季节因具备上述温、湿度条件而成为球虫病高发季节，故民间有…     

夏季肉鸡球虫病多发的原因与对策

1球虫病多发的原因 1.1温度、湿度合适 鸡感染球虫后，球虫在肉鸡消化道内经过一段时间的裂殖生殖，所产生的裂殖子进行配子生殖，最后形成卵囊，随粪便排出体外。新鲜排出的球虫卵囊无感染性，但在一定的条件下（最适温度为22～30℃；湿度20％～30％；充足氧气等）完成孢子生殖，就形成了具有感染力的孢子化卵囊。     

密云地区一起犊牛球虫病的防治分析

正一、奶牛球虫病简介近年来,奶牛场的犊牛时有感染球虫病。断奶后的犊牛多发,出现腹泻、血样粪便,脱水严重可导致死亡。球虫虫卵感染主要多发生在温暖多雨的夏季。一些感染牛和隐性感染成年牛排出球虫卵囊,在温湿的环境中形成孢子化卵囊-感染性卵囊,污染的垫料、饲草和饮水被犊牛吞食,子孢子进入宿主肠上皮细胞内进行无性和有性繁殖导致犊牛出现腹泻、血便等症状。     

仔猪球虫病的防治

正引起仔猪球虫病的主要病因是寄生虫虫体猪等孢子球虫。当然其他球虫类也可以感染猪,但一般不致病。球虫卵囊从受感染的动物脱落后可在农场存活几个月甚至几年。若摄取环境中存留的卵囊,仔猪很容易受到感染。一旦进入小肠,原生动物会经过若干发展阶段,一般需要5~7d形成新的卵囊。每个阶段都可侵入宿主细胞内并大量繁殖再暴发,这     

中药治疗幼隼球虫病

幼隼球虫病是由原生动物门的球虫所引起的一种寄生原虫病,病原为艾美耳属的7种球虫,其中危害最大的有两种：柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫,前者寄生于盲肠中,后者寄生于小肠黏膜中。在临床上往往是多种球虫混合感染。球虫寄生于肠上皮细胞内,球虫卵囊随病幼隼粪便排出体外,在温暖和潮湿的环境里,卵囊经1～3d发育成具有感染性的孢子化卵囊,内含成熟的子孢子。     

鸡球虫体外HCT-8细胞培养模型的建立

由柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)引起的球虫病严重损害鸡的肠道健康,给养鸡业造成巨大的经济损失。E.tenella寄生在鸡盲肠上皮细胞,体外培养可在鸡原代肾细胞内发育成卵囊完成内生发育过程,而在其他传代细胞系内只能完成部分生殖阶段,为了延长其在细胞内的发育进程,建立了鸡球虫HCT-8细胞培养模型。将新鲜制备的E.tenella子孢子接种HCT-8细胞,制备细胞爬片,分别进行HE染色和DAPI染色,观察子孢子在细胞内的发育状况。结果表明,子孢子在接种后6 h即可入侵HCT-8细胞,随后子孢子发育为滋养体至48 h形成第一代裂殖体,至54h第一代裂殖子释放,于72 h形成第二代裂殖体,在144 h第二代裂殖子释放出来,继续培养至168h未见到卵囊形成,而试验虫株接种鸡体后在144～168 h即可观察到大量未孢子化卵囊排出体外,据此确定子孢子在该细胞内的发育过程结束。本研究所建立的鸡球虫细胞培养模型将子孢子发育至第二代裂殖生殖阶段,将发育阶段向前推进了一个进程,为鸡球虫相关研究工作的开展提供技术平台。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG）基因的分离及鉴定

利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

鸡球虫病获得性肠道免疫及免疫防治

家禽重要的肠道原虫包括球虫(艾美尔属、等孢属、稳孢子虫属及肉孢子虫属)和鞭毛虫。由于禽球虫多数隶属艾美尔属，且在商业背景中感染最常见，所以球虫病一般是指由艾美尔属球虫引起的疾病。艾美尔球虫是专性细胞内寄生虫，发育阶段在外界环境和宿主体内交替进行。卵襄随感染鸡的粪便排出，在外界进行孢子生殖，产生具有感染性的子孢子。子孢子被鸡吞食后侵入肠绒毛上皮细胞，经粘膜下层进入腺上皮细胞，无性繁殖产生裂殖子。有性繁殖产生雌雄配子体，两者结合形成卵囊并排入粪中，从而完成生活史。球虫病主要致病表现形式是肠道出血，吸收不良，腹泻及因肠道功能紊乱而造成的增重下降。美国家禽业每年遭受球虫病的损失估计15亿美元。     

柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶2A基因的克隆表达及转录动态分析

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)组蛋白去乙酰化酶2A(Et Sir2A)的生化功能及其对生活史发育的潜在调节作用,以柔嫩艾美耳球虫甘肃株为例,检测其在不同发育阶段表达量的差异。以基因组数据预测的编码序列为模板设计引物,采用RT-PCR的方法扩增得到Et Sir2A的全长ORF,构建p MAL-C2X-Et Sir2A重组表达质粒并进行原核表达;提取未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段/时期的总RNA,采用qRT-PCR方法检测Et Sir2A的转录动态变化。测序结果显示,克隆的Et Sir2A ORF序列全长909 bp,编码302个氨基酸,并能在大肠杆菌原核系统中成功表达;qRT-PCR结果显示,Et Sir2A在不同发育阶段mRNA转录水平差异显著,在未孢子化卵囊阶段最高,第二代裂殖子阶段最低。结果为进一步研究Et Sir2A功能和开发新型抗球虫药物提供了数据基础。     

外源性一氧化氮对鸡柔嫩艾美尔球虫的作用

用酸化亚硝酸钠作为一氧化氮(NO)供体处理新收取的柔嫩艾美尔球虫未孢子化和已孢子化卵囊,来探讨外源性NO对球虫卵囊的抑杀作用。另外通过内服亚硝基谷胱甘肽(GSNO)试验来观察外源性NO对球虫病的防治作用。结果表明,酸化亚硝酸钠溶液(pH=1)对球虫卵囊的孢子生殖具有明显的抑制作用,20mmol/L酸化亚硝酸钠溶液对卵囊孢子生殖的抑制率可达100%;但不经酸化的亚硝酸钠溶液和相同pH的盐酸溶液对卵囊的孢子生殖没有明显影响。经20mmol/L以上浓度酸化亚硝酸钠处理的孢子化卵囊也失去了对雏鸡的致病力,但直接内服GSNO溶液则没有明显的抗球虫作用。这提示外源性NO对鸡柔嫩艾美尔球虫未孢子化和孢子化卵囊均有抑杀作用,但直接内服没有明显的抗球虫病作用。     

球虫消毒剂的筛选及氨水对艾美耳球虫卵囊抑杀条件的优化

为了筛选有效的球虫消毒剂,本研究将柔嫩艾美耳球虫卵囊分别与16种常用消毒剂和1种高效抗球虫药物溶液（250 mg/L妥曲珠利溶液）混合作用2 h然后在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化培养,或混合作用4 h后接种14日龄雏鸡,根据卵囊孢子化率、孢子化抑制率、每克粪便卵囊数量（oocysts per gram of feces,OPG）、病变计分和血便情况评价消毒剂和抗球虫药物抑杀球虫卵囊效果。结果显示,8%氨水对未孢子化卵囊和孢子化卵囊均表现为100%的抑杀效果;250 mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5% NaOH+10% NaCl和5% NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用,孢子化抑制率超过10%,但是对孢子化卵囊抑杀作用不明显;而剩余10种常用消毒剂对球虫卵囊没有明显的抑杀作用。氨水抑杀球虫卵囊条件优化的试验结果显示,1%~8%氨水与未孢子化卵囊作用1 h以上,均可100%抑杀球虫卵囊活性。粪便干扰试验结果显示,粪便不影响2%和4%氨水对球虫卵囊的抑杀效果。本研究结果说明常用消毒剂和抗球虫药物不能有效杀灭球虫卵囊的活性,而氨水是一种高效球虫消毒剂。本研究结果可为开发新型高效球虫消毒剂和球虫病控制提供参考。