一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株的基因组特征

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析.结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 320 nt;与高致病性PRRSV毒株间的全基因组核苷酸相似性为98.6％～98.7％;该毒株基因组的Nsp2编码区除存在与高致病性毒株相同的30个氨基酸的不连续缺失外,还存在468位的氨基酸缺失和在585-586位间插入1个氨基酸,同时,该毒株的结构蛋白GP2、GP3、GP4和M编码区分别存在1个氨基酸的突变.演化分析表明,该毒株尽管与高致病性毒株属于同一亚群,但形成一个独立的小分支.由此表明,该毒株为高致病性PRRSV的变异毒株,说明我国的高致病性PRRSV在流行过程中已出现变异.笔者的研究结果为监测和分析我国的高致病性PRRSV的变异与演化提供了有价值的基因组信息数据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1003株全基因序列测定与分析

为了解广西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采用RT-PCR对PRRSV广西地方分离株GX1003株全基因组进行分段扩增、测序与分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,GX1003株基因组全长为15 320nt。同源性分析表明,GX1003株与比对的国内外PRRSV美洲型毒株全基因核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%和82.1%～99.1%,与欧洲型代表株LV株的同源性分别为60.6%和51.3%。序列分析表明,GX1003株的NSP2编码区存在第481位aa和第533～561aa发生30个氨基酸的不连续缺失,具有高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的遗传特征;同时,在不同编码区出现与HP-PRRSV代表株JXA1株不同的遗传变异现象。遗传进化分析表明,比对的所有美洲型毒株可以分为4个亚群,GX1003株分布在以JXA1株为代表的亚群4中。表明PRRSV广西地方分离株GX1003株属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异。     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009-2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的ORF5和Nsp2(2 503³ 269nt)基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)的序列同源性最高,为96.8%3 269nt)基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)的序列同源性最高,为96.8%⁹8.2%,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),137位为丝氨酸(S),表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)毒株的序列同源性最高,为96.5%98.2%,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),137位为丝氨酸(S),表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)毒株的序列同源性最高,为96.5%⁹8.0%。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的ORF5和Nsp2（2503～3269nt）基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）的序列同源性最高,为96．8％～98．2％,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸（R）,137位为丝氨酸（S）,表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）毒株的序列同源性最高,为96．5％～98．0％。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因序列分析

利用RT-PCR分段扩增的方法,扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中山分离株(ZS-GD株)、珠海分离株(ZH-GD株)覆盖全长基因组的10个片段,分别克隆入pMD18-T载体进行序列测定,获得了PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株基因组全长15320 bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株全基因组序列进行了遗传进化分析,结果显示PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株与美洲型参考株的核苷酸序列相似性分别为88.1%~97.8%和88.4%~98.0%;与欧洲型参考株(Lelystad)的核苷酸序列相似性分别为60.6%和60.4%,且在2株毒的Nsp2蛋白上有30个aa的缺失,表明PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株均为美洲型分离株的缺失变异株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HUB2株全基因组序列分析

从湖北省暴发猪"高热病"的猪场分离出1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),并命名为HUB2株.根据GenBank上已发表的PRRSV全基因序列设计引物进行RTPCR扩增,获得PRRSV HUB2株全基因组cDNA序列.测序结果表明PRRSV HUB2株基因组全长15 320 bp(不包括PolyA尾).分析结果显示该毒株与PRRSV美洲型标准株(VR-2332)和欧洲型标准株(LV)全基因核苷酸同源性分别为89.6%和50.3%.说明HUB2属于美洲型毒株.与VR-2332相比,HUB2株非结构蛋白(Nsp2)存在2处不连续的缺失(共缺失30个氨基酸),其缺失位点位于推定氨基酸序列的第481位和532～560位.此次新出现的强毒株全基因组序列特性的揭示为科学防治猪高致病性蓝耳病奠定了理论基础.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NM1株全基因测序及致病性分析

从内蒙古自治区暴发猪“高热病”的猪场分离出1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ Highly pathogenicporcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV），命名为NM1株。根据GenBank上已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因序列设计引物进行RT—PCR扩增和序列测定，结果表明HPPRRSVNM1株基因组全长15356bp（包括PolyA尾）。分析结果显示该毒株与PRRSV美洲型标准株（VR-2332）和欧洲型标准株（LV）全基因核苷酸同源性分别为89．4％和61．9％，说明NM1属于美洲型毒株。与VR-2332相比，NM1株非结果蛋白（nsp2）第481位和第533～561位氨基酸存在缺失，该毒株属于PRRSV变异株。动物接种试验结果表明，该毒株对猪具有高致病性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。     

PRRSV缺失变异毒株HB-2(sh)/2002在人工感染仔猪组织中的分布与定位

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HB-2(sh)/2002滴鼻感染30日龄健康仔猪,分别于3、7、14、28、42天宰杀,用免疫组化法对呼吸道,泌尿道,生殖道和消化道的主要器官以及脑和主要淋巴器官中的病毒抗原进行了定位分析。结果表明,在各个时间段,病毒抗原阳性率最高的器官为呼吸道、消化道沿途的淋巴结,组织中的阳性细胞多数为巨噬细胞和树突细胞,从个别猪的脑、心肌、肝和呼吸道上皮的细胞检测到阳性信号,同时发现该毒株主要在巨噬细胞和呼吸道腺上皮细胞复制。     

广东省PRRSV流行株的分离鉴定及其Nsp2、ORF3、ORF5基因的遗传变异分析

为了探究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况,分析所分离毒株的分子遗传进化特征,本研究用RT-PCR方法对广东11个地区66个养殖场的189份病料进行了PRRSV的检测,结果表明,样本的PRRSV总阳性率为48.7%(92/189),其中变异株占63.0%(58/92);阳性病例样本经处理后接种Marc-145细胞,成功分离到9株PRRSV。对分离到的9个毒株进行ORF3、ORF5基因和Nsp2主要变异区基因的扩增、克隆、测序和遗传变异分析。序列分析结果发现,其中2株Nsp2基因没有缺失,7株病毒的Nsp2基因发生了与高致病性PRRSV毒株相同的缺失,即第481位有一个氨基酸缺失,第532-560位有连续29个氨基酸缺失。同源性分析表明,分离毒株GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2与国内的HB-1(sh)/2002毒株及其它高致病性PRRSV同源性较高;GDX071108和GDSH1则与VR2332、RespPRRSVMLV、CH-1a的同源性较高,分离株之间的同源性为60.3%-100.0%。系统进化分析发现,GDX071108与PA8和RespPRRSVMLV的亲缘关系很近,与VR2332亲缘关系较近;而GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2则与JXA1、GD、HUB1、HUB2、HN2、HUN1、HNyz、HEB1、HUN4都在HB-1(sh)/2002的同一分支上。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。     

Genetic variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in China from 2002 to 2007 based on ORF5

The complete open reading frame 5 (ORF5) sequences of 34 field porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates from China in 2002–2007 were detected and compared with the different variable Chinese isolates S1, CH-1a, HB-1, HB-2 and JXA1. The results showed that all isolates were of type 2 PRRSV and could be assigned to two clusters. The isolates in cluster sg1 was high similar with the highly pathogenic PRRSV strain JXA1, while sg2 clustered with type 2 PRRSV isolate VR2332. It was interesting that the isolate SH02 which was isolated from Shanghai in 2002 has 98.8% identity with JXA1 emerged in 2006. And the ZJJ07 isolate was found to be a natural recombinant between a Chinese highly pathogenic SY0608 isolate and a VR-2332 derivative NH04 isolate. Analysis of the potential glycosylation sites indicated that they were frequently mutated and formed five putative N-linked glycosylation (NGS) sites patterns based on N30, 33–35, 44 and 51 in those isolates. It indicated that the highly variable PRRSV strain with different NGS patterns spread widely in China. The great genetic diversity could be taken into consideration for the control and prevention of this disease.     

猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒福州株ORF2-7基因结构分析

用RT-PCR方法分段扩增出猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒（PRRSV） FZ株的5条cDNA片段，分别克隆到pMD-18T载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到FZ株ORF2-7编码框序列，测序结果表明该序列长度为3272bp，与BJ 4株、VR 2332株、CH-1a 株和HB-1株核苷酸同源性分别为99.1%、98.9%、93.2%和93.2%。     

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001～2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析.结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001～2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRespPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006～2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ 、SD3,SD4,SD5, SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%～100%,99.4%～99.8%,99.2%～99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支.首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势.     

PRRSV广西分离株GXYL-1403全基因克隆与序列分析

对本实验室所分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403进行全基因组克隆和序列分析。参考已发表的扩增全长PRRSV序列的13对特异性引物,用RT-PCR方法对病毒基因组进行分段扩增。将扩增得到的PCR片段克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。通过软件对所扩增序列进行拼接,获得GXYL-1403的全长序列,并对GXYL-1403进行比较和遗传进化分析。结果表明GXYL1403株基因序列全长为15 018bp,与国内外多株PRRSV毒株进行同源性比较发现,与VR-2332的相似性为89.1%,与TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性达到了97.9%~98.1%。另外,GXYL-1403分离株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别重要的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游出现了连续74个氨基酸的缺失。遗传进化分析发现美洲型PRRSV主要分为3个亚群,GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株属于同一分支,证实了GXYL-1403株为美洲型PRRSV毒株。     

2016-2017年我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株分子遗传演化分析

为了解我国华北地区类NADC30流行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及遗传变异情况,本研究自2016~2017年采集华北四省市(北京、天津、山东及河北)部分猪场疑似PRRSV样品239份进行RT-PCR检测,对所有阳性样品的ORF5基因测序分析及部分阳性样品病毒分离,并选择1株基因缺失病毒TJjh1602株进行全基因的序列扩增及分析.结果显示:PRRSV检测总阳性率44.35%(106/239),遗传进化显示52.83%(56/106)的流行毒株与类NADC30相近且位于系谱1(lineage 1),其中32.14%(18/56)的类NADC30流行毒株具有相同特征性的氨基酸位点缺失;TJjh1602株全基因长度为15018 nt,与NADC30同源性为95.2%,除具有上述特征性氨基酸位点缺失外,无其他插入或缺失.研究结果推测PRRSV类NADC30毒株在我国华北地区广泛流行,同时已遗传演化成一类具有ORF5缺失分子标签的新型类NADC30毒株,提示需进一步加强对PRRSV新型缺失毒株的流行病学调查及相关致病力研究.     

我国南方某省猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株分子流行病学分析

根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332的基因序列设计并合成了一对针对ORF5基因的引物,通过RT-PCR方法对我国南方某省部分地区分离的14个PRRSV分离株进行扩增,获得了大约773bp的DNA片断,将目的片断与pMD18-T载体进行连接并测序。应用DNAStar分析所测序列,并与LV、VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、JX-1等毒株的序列进行比较。核苷酸序列分析表明:14株病毒的与JX-1ORF5基因同源性高达99.0%～99.8%,与CH-1a、HB-1、HB-2同源性达到91.4%～94.9%,与VR-2332、BJ-4同源性达到86.1%～87.6%,与LV同源性仅为55.2%～55.7%。氨基酸序列分析表明:与JX-1同源性高达97.5%～99%;与VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2同源性达到85.6%～94.5%;与LV同源性仅为55.7%～56.2%。可知这14株病毒与JX-1遗传关系较近,可归属同一基因亚群。