三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。     

番鸭源小鹅瘟病毒PT株VP基因的克隆与序列分析

为了获得番鸭(Cairina moschata)源小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)结构蛋白VP基因的相关信息,根据国内外已发表鹅源GPV与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)全基因序列,应用DNAStar分子生物学软件设计一对引物,应用高保真PCR技术扩增番鸭源小鹅瘟病毒PT株(GPV PT株)VP全基因序列.将扩增得到的VP全基因克隆到pMD 18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定.结果表明,PT株VP全基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸(GenBank登录号:JF926695),与番鸭源小鹅瘟病毒GPV DY株核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为98.8％和98.8％,高于鹅源GPV与MDPV参考毒株.在国内外首次发现番鸭源GPV VP基因VP1独特区具有MDPV核苷酸序列特征,而VP2基因具有鹅源GPV核苷酸序列特征.本研究从番鸭源GPV PT株成功克隆到结构蛋白全基因序列,为深入研究番鸭源GPV的起源及水禽细小病毒遗传衍化提供参考.     

温和气单胞菌Z-1株培养特性、免疫原性和毒力的研究

报道了温和气单胞菌Aeromonas sobria Z-1菌株连续传代培养特性、免疫原性及毒力的稳定性.将Z-1菌株在营养琼脂培养基上连续传代至第35代[Z-1(35)],分别检测Z-1(1)、Z-1(5)、Z-1(15)、Z-1(25)和Z-1(35)的培养特性、菌体抗原性及毒力.结果表明:连续传代至35代,Z-1菌株的培养特性、免疫原性及毒力没有显著差异;Z-1株可作为理想的疫苗生产株.     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

2012—2018年福建省部分地区番鸭临床病例细小病毒病病原检测

为初步了解福建省番鸭细小病毒病流行情况,提出相应的防控方法,2012—2018年,在福州、莆田、漳州和三明4个主要番鸭饲养区18个固定养殖场,收集435例临床病例样品,进行番鸭细小病毒病(番鸭三周病和番鸭小鹅瘟)病原检测,分析病原感染状况。结果显示:2012—2018年,在435例临床病例中,检出番鸭细小病毒病病原阳性病例155例,阳性检出率为35.6%(155/435),其中番鸭三周病阳性病例102例,番鸭小鹅瘟阳性病例125例,两种病混合感染病例72例。2012—2014年,番鸭三周病病原检出率约为40.0%,2015年降至27.4%,2016—2018年降至5.0%以下,病原检出率大幅下降(P<0.01);2012—2018年番鸭小鹅瘟病原检出率在23.4%~34.9%之间,检出率下降不明显(P>0.05)。分析认为,2014年番鸭三周病商品疫苗的推广应用大大降低了三周病的临床发病率,使该病已非导致番鸭临床发病的主要因素;而对于番鸭小鹅瘟,因缺乏针对性的有效疫苗,防控效果不明显。因此,该地应继续加强番鸭三周病活疫苗的免疫,最终净化该病;而对于番鸭小鹅瘟,需做好综合防控,可免疫鹅细小病毒弱毒疫苗,控制临床发病,减少疫病造成的损失。     

MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究

为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法 ,筛选细胞浓度、刀豆蛋白ConA浓度和培养时间 3个参数对试验条件进行了研究。结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件 ,细胞浓度 5× 1 0 6个 /mL在 2 0 μg/mLConA的RMPI 1 640完全培养基 40℃培养 60h。试验表明 ,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测     

番鸭呼肠孤病毒MW97106C蛋白基因克隆及其在E．coli中表达

应用RT～PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因，序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp．编码269个氨基酸，相对分子量为29．4ku，DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93％的同源性，而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21％～25％之间，表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中．经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，Western—blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应．表明σC基因表达产物具有免疫原性，为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒病雏番鸭实质器官的超微结构

对人工感染番鸭呼肠孤病毒发病雏番鸭的心、肝、肺、肾、脾脏、胸腺、法氏囊等7种实质器官的超微结构进行了观察。电镜下发现：心、肝、肺、肾等实质器官出现不同程度的细胞变性、水肿以及局灶性溶解坏死；各器官血管内皮细胞脂滴增多、水肿以至坏死脱落．通透性增加；浆细胞、淋巴细胞和吞噬细胞呈散在或灶性浸润于坏死区和实质细胞间。免疫器官脾脏、胸腺和法氏囊中的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋亡，且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增生的吞噬细胞所吞噬，淋巴细胞数量明显减少。上述结果提示，番鸭呼肠孤病毒能导致番鸭免疫抑制。     

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

番鸭小鹅瘟弱毒D株NS蛋白抗原位点特征分析

为获得番鸭小鹅瘟病毒弱毒株(MDGPV-D)非结构蛋白NS基因的相关信息,根据已发表的MDGPV-PT株全基因序列,应用DNAStar分子生物学软件设计1对引物,采用高保真PCR技术扩增MDGPV-D株NS全基因序列。对番鸭小鹅瘟病毒疫苗弱毒D株(MDGPV-D)NS基因进行克隆、测序,并利用生物信息学技术分析MDGPV-D株NS蛋白的同源性、遗传衍化、N-糖基化位点、磷酸化位点、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位及其二级结构。结果表明,D株NS全基因大小为1 884bp,编码627个氨基酸(GenBank登录号:JF926696),与MDPV NS基因的亲缘性最近核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为97.9%～98.6%,97.6%～98.2%;MDGPV-D株NS蛋白具有3个潜在的N-糖基化位点和27个磷酸化位点,可能存在11个B细胞抗原表位,13个CD8+CTL表位,10个CD4+Th抗原表位;二级结构分析显示,α螺旋和无规则卷曲含量高,分别为40.67%、41.15%,而β转角仅占4.63%。与亲本强毒PT株相比,弱毒D株的NS蛋白存在2个定点突变,分别位于核苷三磷酸区域(第338位氨基酸)与CD4+Th抗原表位(第225位氨基酸)。