基因重组山羊痘病毒的构建及鉴定

 将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连,以KpnⅠ为插入位点,将整体基因片段插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P12A3C。与疫苗弱毒株山羊痘病毒共转染BHK21细胞,经绿色荧光筛选,RT-PCR检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

转移载体的构建是重组羊痘病毒构建的重要环节，在分析羊痘病毒基因组的基础上，以TK基因为插入靶序列，经PCR、酶切鉴定，获得了带有EcoRI、BamHⅠ酶切位点的TK基因片段。将此片段与经相同酶切的pUC119载体连接，构建转移载体pUC119-TK，并且以此为基础构建表达绿色荧光蛋白山羊痘病毒转移载体pTK-P7．5-GFP。将pTK-P7,5-GFP转染羊痘病毒感染的BHK21细胞，48h后报告基因得到表达，这为羊痘病毒载体系统的进一步开发奠定了基础。     

山羊痘病毒SS株5个ANK基因缺失的重组病毒构建

为研究锚定蛋白基因(Ankyrin,ANK)对山羊痘病毒的影响,试验采用融合PCR和Overlap PCR技术扩增山羊痘病毒SS株5个ANK基因(ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145)两端侧翼序列和绿色荧光蛋白(GFP)基因,并将其产物连接Trans1-T 1载体构建ANK缺失的转移载体,经过菌液PCR以及质粒双酶切鉴定,阳性重组质粒用Lip 2000转染至已经感染羊痘病毒SS株的羊睾丸原代细胞,依报告基因GFP的表达情况在荧光显微镜下筛选目的基因缺失的重组病毒,同时设立不感染病毒的对照。结果表明:通过融合PCR方法成功扩增山羊痘病毒SS株ANK基因010和138的两端侧翼序列及GFP基因片段,大小约1200 bp;通过Overlap PCR方法成功得到ANK基因140、141.2和145基因的侧翼及GFP基因片段,大小约900 bp,与理论相符。研究成功构建了基因缺失转移载体,将其转染感染SS病毒的细胞中,5个ANK基因缺失的表达载体均可见绿色荧光斑点,说明得到各自基因缺失的重组羊痘病毒。     

共表达口蹄疫病毒vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组山羊痘病毒的构建

将山羊IFN-γ基因插入到合有口蹄疫病毒（FMDV）vp1基因的山羊痘病毒（GPV）转移载体PTK-vp1中,获得合有FMDV vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组转移载体pTK-vp-IFNγ,以本实验室构建的表达β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的山羊痘重组病毒rAY41-LacZ为亲本毒,与转移载体pTK-vp-IFNγ共同转染犊牛睾丸细胞进行同源重组,通过7轮反向蓝白斑筛选,产生重组山羊痘病毒rAY41-VP-IFNγ,通过PCR和间接免疫荧光实验证实获得了能够稳定表达FMDV vp1和山羊IFN-γ的重组山羊痘病毒。     

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

Cloning and Sequence Analysis of A6L Gene of Goatpox Virus

To explore the molecular characteristics of protein A6 from goatpox virus (GTPV), genomic DNA was extracted from goatpox virus Gulang isolate.The specific primers were designed and used to amplify the A6L gene from the genomic DNA by PCR.A PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector.After transformation into E.coli DH5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed with the bioinformatics softwares.The result showed that A6L gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 1128 nucleotides and deduced protein consisted of 375 amino acids with the theoretical molecular weight of 43.68 ku and isoelectric point of 7.50.Analysis of secondary structure of protein A6 revealed that α-helix, β-strand and random coil were 53.30%, 10.24% and 39.46%, respectively.Analysis of multiple sequence alignment indicated A6L gene from different capripoxvirus isolates were highly conserved with identity of more than 97%.The present results laid the foundation for further studies of biological functions of protein A6 and interaction among the early proteins of capripoxvirus.     

山羊痘病毒A6L基因的克隆及序列分析

为了分析山羊痘病毒A6蛋白的分子特征,本试验提取了山羊痘病毒古浪分离株的基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,克隆A6L基因的DNA序列。将PCR产物连接到pGEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对A6L基因序列进行预测分析。结果显示,A6L基因序列含有1个由1128个核苷酸组成的开放阅读框,编码375个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为43.68 ku,理论等电点为7.50。该蛋白的二级结构中,α螺旋占53.30%,β折叠占10.24%,其余39.46%为无规则卷曲。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株A6L序列高度保守,同源性在97%以上。上述研究结果为进一步研究A6蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

Construction of recombinant capripoxviruses as vaccine vectors for delivering foreign antigens: Methodology and application

Goatpox (GTP), sheeppox (SPP) and lumpy skin disease (LSD) are three severe diseases of goat, sheep and cattle. Their typical clinical symptoms are characterized by vesicles, papules, nodules, pustules and scabs on animal skins. The GTP, SPP and LSD are caused by goatpox virus (GTPV), sheeppox virus (SPPV) and lumpy skin disease virus (LSDV), respectively, all of which belong to the genus Capripoxvirus in the family Poxviridae. Several capripoxvirus (CaPV) isolates have been virulently attenuated through serial passaging in vitro for production of live vaccines. CaPV-based vector systems have been broadly used to construct recombinant vaccines for delivering foreign antigens, many of which have been demonstrated to induce effective immune protections. Homologous recombination is the most commonly used method for constructing recombinant CaPVs. Here, we described a methodology for generation of recombinant CaPVs by the homologous recombination, and further reviewed CaPV-vectored vaccines for delivering foreign antigens.     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清