口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建

采用分步 PCR扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因 P1 ,非结构蛋白基因 2 A、2 B、3 C蛋白酶和 3 D聚合酶按正确的读码框依次连接克隆入 p GEM-T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入杆状病毒转移载体 p Mel Bac B。构建成功的重组 p Mel Bac B/P1 2 X3 C3 D转移载体经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,转移载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫 sf9细胞内同源重组 ,以产生重组杆状病毒     

日本血吸虫PDIA3的原核表达和多抗血清制备

为获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)PDIA3(Sj PDIA3)重组蛋白,并制备多克隆抗体血清,本研究以日本血吸虫c DNA文库为模版,利用PCR技术扩增得到PDIA3 ORF全长,并克隆到p ET28a(+)载体中,将得到的重组质粒p ET28aSj PDIA3转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后His-Ni柱亲和层析纯化得到Sj PDIA3重组蛋白,利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blot分析重组蛋白的免疫原性。扩增得到长为1482 bp日本血吸虫PDIA3的ORF序列,该序列编码493个氨基酸,含两个硫氧还原蛋白结构域和一段信号肽,无扩膜结构。在原核表达系统中表达得到大小为55 k Da的Sj PDIA3重组蛋白,分析显示其具有良好的抗原性。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

日本血吸虫四跨膜孤儿受体(TOR)克隆及其第一个膜外区基因的表达

埃及血吸虫和曼氏血吸虫四跨膜孤儿受体(trispanning orphan receptors,TOR)受体可以结合补体C2a,可能在血吸虫免疫逃避过程中起重要作用。为研究日本血吸虫TOR受体的特性和功能,利用PCR扩增到Sj TOR基因并进行了生物信息学分析;同时克隆了Sj TOR基因N端第一个膜外区(ed1)基因,构建了重组质粒p ET-28a-Sj TOR-ed1,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后用组蛋白亲和层析纯化获得重组蛋白Sj TOR-ed1,Western blot结果显示r Sj TOR-ed1能被日本血吸虫阳性小鼠血清识别。该研究为进一步开展研究日本血吸虫TOR受体的功能提供了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。     

羊痘病毒P32蛋白的表达

将已获得的Bac—Bacl—P32、Bac—BacHT—P32重组杆状病毒表达载体转染sf9昆虫细胞，得到含羊痘病毒P32基因的重组杆状病毒rBacHT—P32。将P32基因插入到大肠杆菌表达载体pET30a中，转化BL21感受态细胞，IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定，在杆状病毒、大肠杆菌中都得到了35kDa重组P32蛋白。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

6×His-猪生长激素融合基因在家蚕生物反应器中的表达

将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA基因克隆入转移载体pBacPAK His1,构建了重组转移载体pPGH0 30 ,进而将pPGH0 30与线性化病毒Bm BacPAK6共转染BmN细胞 ,成功获得了猪生长激素重组杆状病毒Bm BacPAK6 pgh。感染重组病毒的细胞可溶性蛋白SDS PAGE和Western blot分析结果显示 ,感染细胞蛋白电泳带的 2 5kD处有 1条猪生长激素特异带。Bm BacPAK6 pgh的BmN细胞培养液接种家蚕 5龄幼虫和蛹 ,感病幼虫与蛹血淋巴的SDS PAGE和Western blot分析结果表明 ,6×His 猪生长激素融合基因在家蚕体内得到了表达 ,特异性条带大小约为 2 5kD。     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。     

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。     

人乙肝病毒前表面抗原PreS1在家蚕培养细胞中的表达

人乙肝病毒前表面抗原PreS1诱导的免疫反应可以克服机体对乙肝病毒S蛋白的无反应状态。将人乙肝病毒adr前表面抗原preS1基因克隆到杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAKpreS1。用此转移载体与线性化病毒BmBacPAK6线性化基因组DNA共转染单层家蚕细胞(BmN),经细胞内同源重组和空白筛选,获得重组病毒。ELISA结果表明重组蛋白PreS1在家蚕培养细胞中的表达水平为02pg/个细胞,Western印迹证实此蛋白大小约为14kD。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

猪带绦虫45W-4B基因在家蚕细胞中的表达

猪带绦虫45W基因已被认为是预防猪囊虫病的基因工程疫苗候选基因之一。其中4B基因是45W基因家族中高度保守的一个成员（以下称45W-4B）。本试验将重组于pGEM-3Z载体上的4B基因转载到pVL1393转移载体中，通过鉴定获得重组质粒pVL1393-4B，然后将重组质粒与BmNPV病毒共转染，筛选出重组BmNPV-4B重组病毒，用该重组病毒感染Bm细胞，收集细胞上清，SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白，并经Western blot检测表明该蛋白能识别囊虫病人（猪）阳性血清，45W-4B蛋白的成功表达对进一步研究45W蛋白的结构和功能以及开发高效猪囊虫基因工程疫苗打下了基础。