日本血吸虫Sj32KD抗原基因的克隆、表达及诊断应用

目的开展日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因研究,探讨其作为诊断抗原的潜力。方法应用PCR方法克隆Sj32KD抗原基因,并在大肠杆菌系统中进行表达,利用H is亲和层析方法纯化融合蛋白,并应用重组的Sj32KD抗原检测羊日本血吸虫病。结果克隆了ORF为1 272bP的日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因,成功构建表达质粒Sj32-pET28 a,并在BL21(DE3)菌株中获得了分子量为47KD的特异性表达产物。应用Sj32KD重组抗原应用于检测羊日本血吸虫病,结果阴性血清的特异性为85.71%,阳性血清的敏感性为95.45%。结论成功克隆表达了日本血吸虫Sj32KD抗原,原核表达融合蛋白有一定的诊断应用潜力。     

日本血吸虫重组蛋白Sj22.6、LHD-Sj23、2LHD-Sj23的表达和抗原性比较

日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)膜相关蛋白Sj22.6和Sj23大亲水区多肽(LHD-Sj23)都具有良好的抗原性,可用于日本血吸虫病的免疫学诊断。本研究通过RT-PCR技术扩增了Sj22.6和LHD-Sj23基因片段,重叠延伸PCR方法融合了2个LHD-Sj23的片段,构建了pET28-Sj22.6、pET28-LHD-Sj23以及pET28-2LHD-Sj23原核表达质粒,在大肠杆菌(Transetta DE3)中表达,获得了rSj22.6、rLHD-Sj23和r2LHD-Sj23三种重组蛋白。用Dot-ELISA方法检测牛日本血吸虫阴阳性血清各10份,比较其敏感性和特异性,结果表明rLHD-Sj23具有较好的效果,为进一步研究利用重组蛋白进行血吸虫血清学诊断奠定基础。     

日本血吸虫TOR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

本研究扩增到日本血吸虫Sj TOR完整的蛋白编码区并将其克隆到p XJ40-FLAG载体的HindⅢ、XhoⅠ酶切位点,构建真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR。将测序正确的质粒转染到293T细胞中进行表达,然后应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot检测其在293T细胞中的表达情况。测序结果表明Sj TOR蛋白编码区为1245 bp,真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR构建成功。转染293T细胞48 h后,应用间接免疫荧光染色可观察到转染重组质粒的细胞有特异性绿色荧光,空质粒对照则未见。实时荧光定量PCR结果显示,在转染质粒p XJ40-FLAG-TOR 6 h后Sj TOR蛋白的基因已有转录,至转染24 h时转录水平最高,随后开始降低。Western blot结果显示Sj TOR蛋白分子量约53 k Da,可被FLAG单抗和抗Sj TOR-ED1抗血清识别。结果表明Sj TOR蛋白可以在293 T细胞中表达,为进一步研究Sj TOR蛋白的生物学功能和DNA疫苗打下了基础。     

日本血吸虫C1q结合蛋白基因的克隆表达及其免疫保护效果评估

本研究利用PCR技术扩增到日本血吸虫C1q BP基因,构建了重组表达质粒p ET-32a(+)-Sj C1q BP,并在大肠杆菌中进行表达。将重组蛋白免疫小鼠评估其免疫保护效果,采用Western blot检测其免疫原性,ELISA检测其特异性抗体水平,应用补体溶血试验分析重组蛋白对补体溶血的抑制效果。结果显示日本血吸虫C1q BP基因含729 bp的编码序列,在大肠杆菌中BL21(DE3)中表达后,用His-Bind亲和层析纯化可获得50 k Da的重组蛋白r Sj C1q BP。应用重组蛋白r Sj C1q BP免疫BALB/c小鼠可产生较高水平的特异性Ig G抗体,诱导36.08%的减虫率和43.45%的肝脏减卵率;补体溶血试验结果表明该重组蛋白能够抑制补体溶血。本研究结果为进一步研究日本血吸虫Sj C1q BP的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清     

日本血吸虫七跨膜基因SjSTMP的鉴定及生物学特性分析

本实验室在扩增血吸虫Wnt信号通路Frizzled受体家族新成员过程中,获得了一个新的七跨膜蛋白(Schistosoma japonicum seven transmembrane protein,Sj STMP)的编码基因,编码含有1141个氨基酸的蛋白质。Sj STMP蛋白仅与Frizzled蛋白具有相似性,有7个穿膜区,N端也具有半胱氨酸富集区,具有作为细胞表面受体的结构基础。Sj STMP的转录随发育调节,在不同发育阶段及不同性别间Sj STMP m RNA水平存在差异,在同一发育阶段的发育正常与发育不良虫体间Sj STMP m RNA水平也存在差异。Sj STMP蛋白在虫体组织内广泛分布,无组织特异性。Sj STMP蛋白功能的进一步确定,将有助于在分子水平了解血吸虫发育调控过程。     

日本血吸虫凋亡相关基因SjBAK的初步研究

利用PCR技术扩增日本吸血虫凋亡相关基因BAK(Bcl-2 homologous antagonist/killer),并构建重组质粒。应用Realtime PCR技术分析在日本血吸虫非易感宿主大鼠和易感宿主小鼠来源、不同发育阶段虫体中BAK基因的表达状况。结果显示,克隆获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)BAK编码基因Sj BAK,其ORF含2142bp,编码713个氨基酸,理论分子量为79.3 k Da,理论等电点为4.9。结构域分析表明该基因编码蛋白具有至少3个BH结构域,属于Bcl家族成员。Real-time PCR结果显示该基因在大、小鼠来源4个不同发育阶段虫体均有表达,其中大鼠来源虫体Sj BAK的表达水平都高于小鼠来源虫体,在感染后32 d和42 d表达差异具有显著统计学意义(P0.05)。由此可推测日本血吸虫凋亡相关基因Sj BAK在血吸虫生长发育中可能发挥重要的作用。     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫钙网质蛋白活化宿主巨噬细胞的初步研究

为研究日本血吸虫钙网质蛋白(Schistosoma japonicum calreticulin protein,Sj CRT)活化小鼠巨噬细胞的功能,利用杆状病毒昆虫细胞表达系统所表达的真核重组的Sj CRT蛋白与巨噬细胞共培养72 h,采用流式细胞术检测巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达。收集Sj CRT蛋白刺激72 h后的巨噬细胞,抽提RNA并反转录为c DNA,利用RT-PCR检测环加氧酶(cyclooxygenase,COX-2)、磷脂酶A2(phospholipases A2,PLA2)、TNF-α和IL-1β基因的表达。Sj CRT与巨噬细胞共孵育72 h后收集上清,ELISA检测上清中TNF-α的含量,Griess法测上清中NO的含量。流式结果显示,与对照组相比,Sj CRT蛋白刺激组的巨噬细胞表面CCR7的表达量增高且差异具有显著统计学意义(P0.05)。与对照组相比,Sj CRT蛋白刺激组巨噬细胞的COX-2、c PLA2、TNF-α和IL-1β表达量显著升高。ELISA结果显示,Sj CRT能够刺激巨噬细胞分泌致炎性因子TNF-α。Griess法表明Sj CRT能够促进巨噬细胞分泌NO。本研究结果表明Sj CRT能活化小鼠巨噬细胞,为阐明其在RA血吸虫疫苗中的功能等提供基础资料。     

日本血吸虫PDIA3的原核表达和多抗血清制备

为获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)PDIA3(Sj PDIA3)重组蛋白,并制备多克隆抗体血清,本研究以日本血吸虫c DNA文库为模版,利用PCR技术扩增得到PDIA3 ORF全长,并克隆到p ET28a(+)载体中,将得到的重组质粒p ET28aSj PDIA3转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后His-Ni柱亲和层析纯化得到Sj PDIA3重组蛋白,利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blot分析重组蛋白的免疫原性。扩增得到长为1482 bp日本血吸虫PDIA3的ORF序列,该序列编码493个氨基酸,含两个硫氧还原蛋白结构域和一段信号肽,无扩膜结构。在原核表达系统中表达得到大小为55 k Da的Sj PDIA3重组蛋白,分析显示其具有良好的抗原性。     

日本血吸虫高迁移率族蛋白活化鼠巨噬细胞的初步研究

为研究日本血吸虫高迁移率族蛋白(Schistosoma japonicum high mobility group box1,Sj HMGB1)体外活化小鼠巨噬细胞的功能,利用真核重组Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共培养48 h,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志分子以及趋化因子受体的表达。收集Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共孵育48 h后上清,ELISA检测上清中TNF-α与IL-10的含量,Griess法检测上清中NO的含量。流式结果显示,与对照组相比,Sj HMGB1蛋白刺激组的巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子,TLR4受体以及趋化因子受体CCR7的表达显著上调且差异具有极显著统计学意义(P0.01),TLR2受体的表达显著下调,差异具有显著统计学意义(P0.05)。ELISA结果显示,Sj HMGB1能够刺激巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α,未能促进抑炎因子IL-10的释放。Griess法表明Sj HMGB1能够促进巨噬细胞分泌NO。本研究结果表明Sj HMGB1可能通过TLR4通路活化小鼠巨噬细胞并诱导其向致炎性M1型巨噬细胞极化。     

应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究

为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度.优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时机等培养条件.研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH 7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5 h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32 mg/L发酵液,菌体密度达到13 OD左右.     

日本血吸虫Sj22.6-LHD-Sj23融合基因的克隆及原核表达

为获得具有良好抗原性的日本血吸虫重组蛋白,本研究设计了两对特异性引物,以日本血吸虫mRNA为模板,RT-PCR方法分别克隆基因片段Sj22.6ku和LHD-Sj23,以重叠延伸PCR方法将两个片段连接,构建原核重组表达质粒pET28-Sj22.6-LHD-Sj23;该重组质粒在大肠杆菌Rosetta DE3中表达后所获得的融合蛋白Sj22.6-LHD-Sj23分子量约为35 ku。Western blot鉴定结果表明该重组蛋白有良好的免疫原性,为进一步研制日本血吸虫病分子诊断试剂盒奠定了基础。     

日本血吸虫SjCHGC06822蛋白诱导BALB/c小鼠免疫保护效果观察

利用PCR技术扩增日本血吸虫Sj CHGC06822 ORF全长序列,以p ET28a(+)为载体构建重组质粒,大肠杆菌表达系统进行表达,His-Ni柱层析纯化r Sj CHGC06822/His蛋白后,生物信息学分析其可能结构,Western blot分析其抗原性。利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠评估其免疫效果,ELISA分析血清抗体亚型变化。结果显示,获得日本血吸虫Sj CHGC06822的完整ORF序列591 bp,编码192个氨基酸,序列aa37~aa72含一个EF-hand手性域结构,无信号肽及跨膜结构。获得的Sj CHGC06822/His重组蛋白具有较好的抗原性,在2次独立BALB/c小鼠实验中,与PBS对照组相比,Sj CHGC06822/His蛋白免疫组诱导小鼠获得30.36%、40.26%减虫率和30.14%、12.28%肝脏减卵率,血清Ig G抗体免疫及感染后持续增高,Ig G2a和Ig G1水平随免疫次数增高,感染后出现下降,但Ig G2a/Ig G1(1)水平持续增加。本研究成功克隆了Sj CHGC06822基因,并成功表达纯化了r Sj CHGC06822/His蛋白,且免疫原性和反应原性良好。Sj CHGC06822蛋白免疫可以诱导BALB/c小鼠产生一定的保护力,诱导宿主的免疫应答更偏向于Th1型。     

表达日本血吸虫凋亡抑制因子的重组腺病毒的构建和鉴定

为探讨腺病毒介导的基因操作技术在血吸虫基因功能中的应用,本研究构建了表达日本血吸虫凋亡抑制因子(an inhibitor apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP)的腺病毒,免疫印迹分析表明获得了表达SjIAP的重组病毒,并对重组病毒的滴度进行了测定.本研究为进一步利用腺病毒对血吸虫基因操作相关研究及SjIAP的功能奠定了基础.     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

日本血吸虫Sj314C10基因的获得及其DNA疫苗的构建

利用快速cDNA末端扩增(RACE)技术结合“电子cDNA文库”筛选法，对日本血吸虫成虫期特异表达基因EST片段的全长序列进行了扩增，获得了一含完整开放性阅读框(ORF)的基因序列(GenBank中的登录号为AY847290)。经对该基因序列进行分析，表明其为日本血吸虫的一新基因，命名为Sj314C10。将该基因的蛋白编码区克隆到真核表达载体pcDNA3中，把构建好的重组质粒转化到大肠埃希氏菌DH5α中培养；筛选阳性克隆进行序列鉴定，经分析表明与预期的结果一致。成功地构建了该基因的DNA疫苗，为该基因作为疫苗候选分子的研究奠定了基础。     

日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位及mRNA表达水平分析

为研究日本血吸虫(Sj)Wnt信号分子受体SjFz5(Frizzled5)在Sj生长发育中的作用,本实验对其在不同发育阶段的mRNA转录水平及组织分布进行了检测,并采用定量PCR方法比较SjFz5基因在Sj不同发育阶段间的mRNA水平差异。以7 d童虫cDNA为模板,扩增SjFz5基因编码胞外区CRD(Cystein rich domain)的基因片段,构建pET-SjFz5-CRD表达重组质粒进行原核表达。以纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并进行SjFz5蛋白的组织定位。结果显示:SjFz5基因mRNA在发育早期表达水平相对较高,其中7 d童虫中表达量最高,13 d和18 d童虫下调了约1/3。23 d及其后雌雄虫的表达水平继续下调,雄虫下调比雌虫略显缓慢。整个成虫阶段SjFz5 mRNA维持在一个相对较低的水平。免疫组化结果显示SjFz5蛋白在虫体组织中分布广泛,其中雌雄虫生殖器官组织中的分布最为明显。随着卵巢和睾丸的逐步发育,SjFz5蛋白的量也呈现增加的趋势。SjFz5 mRNA在7 d童虫内表达量最高,SjFz5蛋白在雌雄生殖器官组织中分布最为明显,提示其介导的Wnt信号通路可能参与调节童虫阶段的细胞增殖、器官分化,并可能调节两性生殖细胞的发育。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗体水平检测与分析

东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，观察东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后的特异性抗体水平变化，可为阐明其抗病机制提供依据。本试验用间接ELISA方法检测东方田鼠抗成虫可溶性抗原（SWAP）和几种日本血吸虫基因重组抗原（Sj28-GST、LHD-SjTP1、C-SjParamyosion）的特异性抗体水平动态变化，并检测东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前、后的IgG3亚类特异性抗体水平。结果东方田鼠在攻击日本血吸虫尾蚴后，抗SWAP的特异性抗体水平有所升高，而抗几体基因重组抗原的特异性抗体水平低，没有显著变化。东方田鼠正常血清中抗SWAP和IgG3亚类抗体的OD值是牛血清白蛋白（BSA）对照的31倍。结果表明，在东方田鼠血清中有较高水平的SWAP的IgG3亚类抗体，值得进一步深入探讨。     

应用LHD-Sj23和SjCL基因重组抗原诊断水牛日本血吸虫病的研究

目的：验证日本血吸虫基因重组抗原检测水牛日本血吸虫病的效果。方法：以日本血吸虫基因重组抗原LHD-Sj23／pGEX和SjCL／pET-28a( )作为抗原，应用ELISA法检测水牛日本血吸虫病。结果：感染日本血吸虫病阳性符合率分别为93．3％(42／45)和95．6％(43／45)，阴性符合率分别为93．3％(42／45)和80％(36／45)。和以血吸虫成虫抗原(SWAP)和虫卵(SEA)抗原作为诊断抗原获得的结果差异不明显。同时将上述两种基因重组抗原混合作为诊断抗原，检测水牛血吸虫病，结果阳性符合率为88．9％(40／45)，阴性符合率为33．3％(15／45)。结论：由于基因重组抗原制备简便、价廉，有利于诊断技术的标准化。因此，基因重组抗原在血吸虫病诊断领域有着良好的研究和应用前景。