日本血吸虫Sj32KD抗原基因的克隆、表达及诊断应用

目的开展日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因研究,探讨其作为诊断抗原的潜力。方法应用PCR方法克隆Sj32KD抗原基因,并在大肠杆菌系统中进行表达,利用H is亲和层析方法纯化融合蛋白,并应用重组的Sj32KD抗原检测羊日本血吸虫病。结果克隆了ORF为1 272bP的日本血吸虫中国大陆株Sj32KD抗原基因,成功构建表达质粒Sj32-pET28 a,并在BL21(DE3)菌株中获得了分子量为47KD的特异性表达产物。应用Sj32KD重组抗原应用于检测羊日本血吸虫病,结果阴性血清的特异性为85.71%,阳性血清的敏感性为95.45%。结论成功克隆表达了日本血吸虫Sj32KD抗原,原核表达融合蛋白有一定的诊断应用潜力。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗体水平检测与分析

东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，观察东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后的特异性抗体水平变化，可为阐明其抗病机制提供依据。本试验用间接ELISA方法检测东方田鼠抗成虫可溶性抗原（SWAP）和几种日本血吸虫基因重组抗原（Sj28-GST、LHD-SjTP1、C-SjParamyosion）的特异性抗体水平动态变化，并检测东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前、后的IgG3亚类特异性抗体水平。结果东方田鼠在攻击日本血吸虫尾蚴后，抗SWAP的特异性抗体水平有所升高，而抗几体基因重组抗原的特异性抗体水平低，没有显著变化。东方田鼠正常血清中抗SWAP和IgG3亚类抗体的OD值是牛血清白蛋白（BSA）对照的31倍。结果表明，在东方田鼠血清中有较高水平的SWAP的IgG3亚类抗体，值得进一步深入探讨。     

日本血吸虫SjCHGC06822蛋白诱导BALB/c小鼠免疫保护效果观察

利用PCR技术扩增日本血吸虫Sj CHGC06822 ORF全长序列,以p ET28a(+)为载体构建重组质粒,大肠杆菌表达系统进行表达,His-Ni柱层析纯化r Sj CHGC06822/His蛋白后,生物信息学分析其可能结构,Western blot分析其抗原性。利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠评估其免疫效果,ELISA分析血清抗体亚型变化。结果显示,获得日本血吸虫Sj CHGC06822的完整ORF序列591 bp,编码192个氨基酸,序列aa37~aa72含一个EF-hand手性域结构,无信号肽及跨膜结构。获得的Sj CHGC06822/His重组蛋白具有较好的抗原性,在2次独立BALB/c小鼠实验中,与PBS对照组相比,Sj CHGC06822/His蛋白免疫组诱导小鼠获得30.36%、40.26%减虫率和30.14%、12.28%肝脏减卵率,血清Ig G抗体免疫及感染后持续增高,Ig G2a和Ig G1水平随免疫次数增高,感染后出现下降,但Ig G2a/Ig G1(1)水平持续增加。本研究成功克隆了Sj CHGC06822基因,并成功表达纯化了r Sj CHGC06822/His蛋白,且免疫原性和反应原性良好。Sj CHGC06822蛋白免疫可以诱导BALB/c小鼠产生一定的保护力,诱导宿主的免疫应答更偏向于Th1型。     

日本血吸虫7d童虫cDNA文库构建及免疫筛选

为了从7 d童虫cDNA文库筛选出童虫发育阶段特异性表达抗原基因。本研究首先构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库,其次再采用日本吸血虫感染血清进行筛选。结果显示:建立的文库插入片段为0.5~3.0 kb,文库重组率为98%,初始文库滴度为2.4×10~6 pfu/mL,扩增后滴度为1.6×10~9 pfu/mL,利用感染日本血吸虫10 d和42 d的小鼠血清免疫筛选该文库,初筛和复筛后获得17条有效EST序列,其编码7个基因,分别为复制蛋白(2 ESTs)、肝再生增强因子(3 ESTs)、血小板活化因子(6 ESTs)、钙调理蛋白基因(3 EST)、丝束蛋白(1 ESTs)、核糖体RNA(1 EST)和还原型辅酶脱氢酶基因(1 EST)。该研究结果对今后探讨血吸虫的生长发育机制及筛选血吸虫早期诊断抗原具有重要意义。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

东方田鼠IgG和IgG3对日本血吸虫抗原反应特性的研究

本文对东方田鼠(Microtus fortis)总IgG和IgG3对日本血吸虫抗原的反应特性进行了研究.纯化东方田鼠IgG,用间接ELISA法检测不同浓度东方田鼠总IgG和IgG3对日本血吸虫童虫可溶性抗原(soluble schistosomula antigen,SSA)、成虫可溶性抗原(soluble adult worm antigen,SWA)、虫卵可溶性抗原(soluble egg antigen,SEA)、童虫不可溶性抗原(insoluble schistosomula antigen,ISSA)、雄虫不可溶性抗原(insoluble male worm antigen,ISMA)、雌虫不可溶性抗原(insoluble female worm antigen,ISFA),以及基因工程抗原rSj14、rSj23-HLD、rSJ28GST、rSjPP的反应情况.结果显示,HRP标记免抗东方田鼠IgG抗体和羊抗小鼠IgG3抗体作为二抗,A值变化规律一致.该结果显示东方田鼠总IgG和IgG3与日本血吸虫抗原可能存在非特异性反应.     

日本血吸虫C1q结合蛋白基因的克隆表达及其免疫保护效果评估

本研究利用PCR技术扩增到日本血吸虫C1q BP基因,构建了重组表达质粒p ET-32a(+)-Sj C1q BP,并在大肠杆菌中进行表达。将重组蛋白免疫小鼠评估其免疫保护效果,采用Western blot检测其免疫原性,ELISA检测其特异性抗体水平,应用补体溶血试验分析重组蛋白对补体溶血的抑制效果。结果显示日本血吸虫C1q BP基因含729 bp的编码序列,在大肠杆菌中BL21(DE3)中表达后,用His-Bind亲和层析纯化可获得50 k Da的重组蛋白r Sj C1q BP。应用重组蛋白r Sj C1q BP免疫BALB/c小鼠可产生较高水平的特异性Ig G抗体,诱导36.08%的减虫率和43.45%的肝脏减卵率;补体溶血试验结果表明该重组蛋白能够抑制补体溶血。本研究结果为进一步研究日本血吸虫Sj C1q BP的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫中国大陆株Sj23抗原基因在家蚕细胞中的表达及鉴定

将日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白 (Sj2 3抗原 )基因从原核表达载体 p ET2 8(c)中亚克隆入转移载体 p Bac PAK- His1,构建了 p Bac PAK- his1- Sj2 3转移载体 ,并与线性化家蚕杆状病毒共转染家蚕细胞 ;经 PCR鉴定得到重组病毒 ,经过蓝、白斑筛选得到纯化的重组病毒 ;SDS- PAGE显示日本血吸虫 2 30 0 0膜蛋白基因在家蚕细胞中实现表达 ,蛋白的相对分子质量为 2 6 0 0 0 ;重组 Sj2 3经 Western- Blot鉴定能够识别血吸虫感染多克隆兔血清     

日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)基因的克隆表达及其免疫保护效果分析

为了评估日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)在小鼠体内诱导的免疫保护效果,应用PCR获得SjNADH基因片段,其开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸,并在大肠杆菌中成功表达,纯化得到该重组蛋白。Western blot结果显示,SjNADH在日本血吸虫童虫和成虫中的表达量稳定,SjNADH融合蛋白也能被免疫血清识别,具有较好的免疫原性。应用重组蛋白免疫小鼠能诱导产生较高的特异性抗体水平,并诱导了20.13%的减虫率和23.06%的肝脏减卵率。结果表明,获得的SjNADH重组蛋白在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护,有作为血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力。     

日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位及mRNA表达水平分析

为研究日本血吸虫(Sj)Wnt信号分子受体SjFz5(Frizzled5)在Sj生长发育中的作用,本实验对其在不同发育阶段的mRNA转录水平及组织分布进行了检测,并采用定量PCR方法比较SjFz5基因在Sj不同发育阶段间的mRNA水平差异。以7 d童虫cDNA为模板,扩增SjFz5基因编码胞外区CRD(Cystein rich domain)的基因片段,构建pET-SjFz5-CRD表达重组质粒进行原核表达。以纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并进行SjFz5蛋白的组织定位。结果显示:SjFz5基因mRNA在发育早期表达水平相对较高,其中7 d童虫中表达量最高,13 d和18 d童虫下调了约1/3。23 d及其后雌雄虫的表达水平继续下调,雄虫下调比雌虫略显缓慢。整个成虫阶段SjFz5 mRNA维持在一个相对较低的水平。免疫组化结果显示SjFz5蛋白在虫体组织中分布广泛,其中雌雄虫生殖器官组织中的分布最为明显。随着卵巢和睾丸的逐步发育,SjFz5蛋白的量也呈现增加的趋势。SjFz5 mRNA在7 d童虫内表达量最高,SjFz5蛋白在雌雄生殖器官组织中分布最为明显,提示其介导的Wnt信号通路可能参与调节童虫阶段的细胞增殖、器官分化,并可能调节两性生殖细胞的发育。     

Comparison of the vaccine efficacy of gamma-irradiated Schistosoma japonicum cercariae with the defined antigen Sj62(IrV-5) in pigs

Development of a vaccine against Schistosoma japonicum which can protect both man and the domestic animal zoonotic reservoirs of infection would be an invaluable tool in attempts to control this infection in those areas in which conventional control methods have failed to break transmission. The pig is a natural host of S. japonicum and because of its anatomical and immunological similarities to humans, it is a potentially valuable host for studies on S. japonicum in particular and schistosomes in general. Radiation-attenuated cercariae are highly effective in inducing immunity in experimental schistosomosis and there are promising reports of partial protection against schistosomes with recombinant-derived individual antigens. In the present study we have set out to establish a protocol for inducing protection with gamma-irradiated cercariae in pigs and to assess the protective capacity of recombinant and naked DNA formulations of Sj62, a 62kDa region of S. japonicum myosin. The corresponding S. mansoni version or Sj62, recombinant IrV-5, has previously been implicated in irradiated vaccine immunity in S. mansoni infections and has been shown to induce high levels of immunity in a variety of hosts.Groups of pigs were immunised three times at 2-week intervals with 2000 cercariae irradiated at 20krad, with Sj62 as a recombinant (rSj62) incorporated in Freund's adjuvant, a micellar preparation, or as a naked DNA construct. Vaccination with irradiated cercariae did not induce significant anti-Sj62 antibody but following intramuscular challenge with 2000 cercariae, the vaccinated pigs showed >95% resistance as assessed by reduced faecal egg output, worm tissue egg burdens and also reduced septal fibrosis. Immunisation with each of the Sj62 formulations induced significant anti-Sj62 antibody responses, the highest titre (>12,800) being with the Freund's preparation but none of the Sj62-immunised groups showed significant resistance to challenge. The data suggest that Sj62 shows little promise as a vaccine candidate for schistosomosis.     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

Characterization of a novel vaccine candidate and serine proteinase inhibitor from Schistosoma japonicum (Sj serpin)

Serine proteinase inhibitors (serpins) represent an important superfamily of endogenous inhibitors that regulate proteolytic events active in a variety of physiological functions. Immunological screening of a Schistosoma japonicum adult worm cDNA expression library with sera of Microtus fortis, a naturally resistant vertebrate host, has identified one clone that encoded for a sequence homologous to those of the serpin superfamily. The full-length sequence encoding S. japonicum serpin (Sj serpin) was amplified from adult worm cDNA by using 5'-RACE-PCR and subsequently cloned into the prokaryotic expression vector pET28c. The full-length Sj serpin fusion-protein with his-tag was expressed in E. coli, purified by affinity chromatography and used to immunize New Zealand white rabbits. Sj serpin is located on the tegument in S. japonicum adult worms. C57BL/6 mice immunized with Sj serpin induced the production of high levels of specific IgE and IgG1 subclass antibodies as well as a marked IL-4 response. Lymphocyte surface marker analysis revealed proliferation of CD19 expressing B cells, indicating a predominant Th2-type response to Sj serpin. Immunized mice developed moderate protection against infection of S. japonicum as demonstrated by a 36 and 39% reduction in the recovery of adult worms and eggs, respectively. These data suggested a role for Sj serpin as a vaccine candidate or as a novel target for anti-schistosome drugs.     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

Vaccination of mice against schistosoma bovis with a recombinant fatty acid binding protein from Fasciola hepatica

Two strains of mice (NMRI and C57/BL) were each immunized with a 15kDa recombinant Fasciola hepatica fatty acid binding protein (FABP) (Fh15) and challenged percutaneously with Schistosoma bovis cercariae. C57/BL mice immunized with Fh15 had significant reductions in S. bovis worm burden recoveries (72% reductions over controls). When using NMRI mice, Fh15 in Freund's adjuvant failed to induce significant protection against S. bovis. In C57/BL mice, only antibodies to the IgG2a isotype increased after the second immunization and remained high through 8 weeks of S. bovis infection. This is the first time that a heterologous recombinant molecule from F. hepatica has been used in vaccination against S. bovis, obtaining a significant reduction in the number of worms in C57/BL mice.