抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。     

山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒ORF122蛋白为免疫抗原,构建杂交瘤细胞株,制备ORF122蛋白单克隆抗体。用纯化的ORF122蛋白免疫BALB/c小鼠后,按通用的方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒ORF122蛋白的杂交瘤细胞,制备ORF122蛋白单克隆抗体,获得6株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在104以上。山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备,为山羊痘病毒的进一步研究提供了生物材料。     

非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。     

山羊痘病毒P32蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

基于山羊痘病毒P32蛋白ELISA检测方法的建立

P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法，试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白，将其纯化后免疫小鼠，获得阳性杂交瘤细胞，通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株，并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化，初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠，抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞，将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.     

基于山羊痘病毒P32蛋白间接ELISA方法的建立

通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对真核表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析GPVP32蛋白纯化效果;应用琼脂扩散试验检测纯化蛋白的抗原反应性,并以纯化蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,从真核表达产物中获得了纯化的GPVP32蛋白,琼脂扩散试验显示纯化的GPVP32蛋白具有良好的抗原反应性;基于纯化蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于山羊痘流行病学的调查和血清抗体水平的监测,为山羊痘的防控提供了有效技术。     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。     

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV) VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5).经鉴定,该mAb为IgGl亚型,轻链为κ链.Western blot试验结果表...     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用杆状病毒表达系统表达虾源副溶血性弧菌编码蛋白PirB的重组蛋白,用SDS-PAGE、Western blot对其进行鉴定,纯化后的PirB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后进行细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,用ELISA方法对单克隆抗体进行测定。结果发现,共筛选到7株能够稳定分泌抗PirB蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,小鼠腹水的效价最高效价达到1∶2.56×106,制备的单克隆抗体可以特异性识别PirB蛋白,表明成功制备了虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体,为虾源副溶血性弧菌引发的疾病诊断奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的表达与单克隆抗体的制备

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP96R蛋白单克隆抗体,根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R基因序列设计引物,PCR扩增后连接表达载体pET28a-SUMO构建pET-SUMO-DP96R原核表达质粒,将该质粒转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导,获得可溶性的DP96R蛋白。通过Western blot鉴定该蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,共制备了14株针对DP96R蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1、IgG2a,轻链亚类均为κ。采用DP96R蛋白为抗原的间接ELISA方法检测抗体的效价均不低于1∶2 560 000, 14株单克隆抗体均能够特异性识别DP96R蛋白。本试验为进一步研究DP96R蛋白生物学功能及ASFV基因缺失疫苗开发提供了重要的生物材料。     

Generation and characterization of monoclonal antibodies to equine NKp46

The immunoreceptor NKp46 is considered to be the most consistent marker of NK cells across mammalian species. Here, we use a recombinant NKp46 protein to generate a panel of monoclonal antibodies that recognize equine NKp46. The extracellular region of equine NKp46 was expressed with equine IL-4 as a recombinant fusion protein (rIL-4/NKp46) and used as an immunogen to generate mouse monoclonal antibodies (mAbs). MAbs were first screened by ELISA for an ability to recognize NKp46, but not IL-4, or the structurally related immunoreceptor CD16. Nine mAbs were selected and were shown to recognize full-length NKp46 expressed on the surface of transfected CHO cells as a GFP fusion protein. The mAbs recognized a population of lymphocytes by flow cytometric analysis that was morphologically similar to NKp46+ cells in humans and cattle. In a study using nine horses, representative mAb 4F2 labeled 0.8-2.1% PBL with a mean fluorescence intensity consistent with gene expression data. MAb 4F2+ PBL were enriched by magnetic cell sorting and were found to express higher levels of NKP46 mRNA than 4F2- cells by quantitative RT-PCR. CD3-depleted PBL from five horses contained a higher percentage of 4F2+ cells than unsorted PBL. Using ELISA, we determined that the nine mAbs recognize three different epitopes. These mAbs will be useful tools in better understanding the largely uncharacterized equine NK cell population.     

Production and characterization of rabbit anti-idiotypic antibodies directed against a murine monoclonal anti-B. abortus antibody

The protective anti-B. abortus monoclonal antibody ISS/32 (Ab1) was used as an immunogen to induce anti-idiotypic antibodies (Ab2) in rabbits. The purpose was to produce and characterize anti-idiotypic antibodies that share conformational similarity with the corresponding bacterial epitope recognized by Ab1. The rabbit anti-IdAb so induced was isolated and affinity-purified. Its specificity for the paratope of Ab1 was determined by evaluating its ability to compete withB. abortus for binding to Ab1 in a competitive ELISA assay. The anti-idiotypic ISS/32 antibodies were able to compete withB. abortus for binding to Ab1 in a dose-dependent manner. Hence, the data indicated that the rabbit anti-Id ISS/32 antibodies reacted with or near the antigen-binding site of Ab1.Abbreviations Ab antibody - anti-Id anti-idiotypic - ELISA enzyme linked immunosorbent assay - IgG immunoglobulin - i.p. intraperitoneal - mAb monoclonal antibody - PBS phosphate-buffered saline - s.c. subcutaneously - TD PBS + 0.05% Tween 20% + 1% yeast extract     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...