共表达AsiaⅠ型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因重组山羊痘病毒的构建及鉴定

将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连,以KpnⅠ为插入位点,将整体基因片段插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P12A3C。与疫苗弱毒株山羊痘病毒共转染BHK21细胞,经绿色荧光筛选,RT-PCR检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。     

基因克隆测序与原核表达

 根据GenBank中登录的犬瘟热病毒h基因序列设计一对引物，利用RT-PCR方法扩增出犬瘟热病毒弱毒疫苗株的h基因，将其插入到克隆载体pMD18-T中，经蓝白斑筛选及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定挑出阳性克隆进行序列测定，序列分析结果表明，该基因与GenBank上标准代表毒株序列完全同源；与扬州分离株、长春分离株、新疆分离株、日本分离株D85755同源性分别为90.6%、91.3%、90.5%、91%；与Onderstepoort、Convac株、美国分离株98-2666-2同源性较高，分别为97.7%、97.2%、98.1%。再将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中，转化感受态E.coli BL21细胞，经IPTG诱导表达分子质量约64 ku的重组H蛋白。     

胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化

 从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)₁₅-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。     

8区域4种微卫星标记多态性研究

 选择了2号染色体GDF8区域可能与生产性能相关性较大的4个高度多态微卫星基因座 （BM81124，TEXAN2，FCB128，BMS1591），分析这些位点在 Dorset、Suffolk和Texel 3个肉羊品种的多态分布情况。结果表明，这4个微卫星标记在3个绵羊品种中的等位基因数分别为:10、12、7、11，其多态信息含量/杂合度分别为:0.7778/0.8045、0.712/0.7520、0.7551/0.7852、0.8057/0.8289，可见这些微卫星位点在3个绵羊品种中具有比较丰富的多态性。因此它们可以作为进行生产性状与标记间连锁分析的遗传标记，用于进一步的QTL定位研究。     

山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

转移载体的构建是重组羊痘病毒构建的重要环节，在分析羊痘病毒基因组的基础上，以TK基因为插入靶序列，经PCR、酶切鉴定，获得了带有EcoRI、BamHⅠ酶切位点的TK基因片段。将此片段与经相同酶切的pUC119载体连接，构建转移载体pUC119-TK，并且以此为基础构建表达绿色荧光蛋白山羊痘病毒转移载体pTK-P7．5-GFP。将pTK-P7,5-GFP转染羊痘病毒感染的BHK21细胞，48h后报告基因得到表达，这为羊痘病毒载体系统的进一步开发奠定了基础。     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

山羊痘病毒SS株5个ANK基因缺失的重组病毒构建

为研究锚定蛋白基因(Ankyrin,ANK)对山羊痘病毒的影响,试验采用融合PCR和Overlap PCR技术扩增山羊痘病毒SS株5个ANK基因(ANK010、ANK138、ANK140、ANK141.2和ANK145)两端侧翼序列和绿色荧光蛋白(GFP)基因,并将其产物连接Trans1-T 1载体构建ANK缺失的转移载体,经过菌液PCR以及质粒双酶切鉴定,阳性重组质粒用Lip 2000转染至已经感染羊痘病毒SS株的羊睾丸原代细胞,依报告基因GFP的表达情况在荧光显微镜下筛选目的基因缺失的重组病毒,同时设立不感染病毒的对照。结果表明:通过融合PCR方法成功扩增山羊痘病毒SS株ANK基因010和138的两端侧翼序列及GFP基因片段,大小约1200 bp;通过Overlap PCR方法成功得到ANK基因140、141.2和145基因的侧翼及GFP基因片段,大小约900 bp,与理论相符。研究成功构建了基因缺失转移载体,将其转染感染SS病毒的细胞中,5个ANK基因缺失的表达载体均可见绿色荧光斑点,说明得到各自基因缺失的重组羊痘病毒。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

基因表达的影响

 试验旨在研究不同日粮代谢能水平对北京油鸡脂肪沉积及脂蛋白酯酶（LPL）基因mRNA表达影响。试验以3周龄北京油鸡公鸡为研究对象，将480只公鸡随机分为4组，分别饲喂4个代谢能水平的日粮（12.122、12.540、12.958和13.376 MJ/kg），每个处理组5个重复，每个重复24只鸡。试验期为10周。采用荧光定量PCR方法检测LPL基因mRNA表达水平。结果表明，日粮代谢能水平对鸡体脂沉积各项指标和LPL基因mRNA表达水平影响极显著，随日粮代谢能水平提高，各项体脂沉积指标极显著上升，胸肌和腿肌IMF、皮脂重和皮脂率在ME3达到峰值，LPL基因mRNA表达水平在ME2组达到峰值（P＜0.01）。LPL基因mRNA表达水平与腹脂率、皮脂重和皮脂率呈显著正相关（P＜0.05）。研究结果提示，日粮代谢能水平显著影响北京油鸡体脂沉积和LPL基因mRNA表达；LPL基因表达影响北京油鸡体脂沉积状况。     

共表达口蹄疫病毒vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组山羊痘病毒的构建

将山羊IFN-γ基因插入到合有口蹄疫病毒（FMDV）vp1基因的山羊痘病毒（GPV）转移载体PTK-vp1中,获得合有FMDV vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组转移载体pTK-vp-IFNγ,以本实验室构建的表达β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的山羊痘重组病毒rAY41-LacZ为亲本毒,与转移载体pTK-vp-IFNγ共同转染犊牛睾丸细胞进行同源重组,通过7轮反向蓝白斑筛选,产生重组山羊痘病毒rAY41-VP-IFNγ,通过PCR和间接免疫荧光实验证实获得了能够稳定表达FMDV vp1和山羊IFN-γ的重组山羊痘病毒。     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。     

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

表达红色荧光蛋白的重组鸭肠炎病毒的构建及鉴定

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白_^[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白_^[2]、鸭坦布苏病毒E基因_^[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白_^[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。     

猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。     

1基因对菊苣的转化和耐盐性研究

用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入菊苣中,共获得４２株卡那霉素（Ｋａｎ）抗性再生植株。经过ＰＣＲ 检测、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ 检测表明,AtNHX1基因已成功整合到菊苣基因组中,并且能够正常转录。野生型和转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验,结果显示,相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织。施加梯度ＮａＣｌ胁迫后,植株叶片Ｋ^＋ 和Ｎａ^＋ 含量测定结果显示,转基因植株叶片比野生型积累更多的Ｎａ^＋ 和Ｋ^＋ ,维持较高的Ｋ^＋／Ｎａ^＋ ;叶片相对电导率测定结果表明,转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型。上述结果表明,AtNHX1基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害。