| 重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用 |
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| 引用本文： | 曹素芳,王岩.重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用[J].中国兽医学报,2013,33(8). |
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| 作者姓名： | 曹素芳 王岩 |
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| 作者单位： | 郑州牧业工程高等专科学校动物医学系,河南郑州,450011 |
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| 基金项目： | 河南省高校科技创新人才支持计划资助项目，河南省教育厅自然科学研究计划资助项目 |
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| 摘 要： | 构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3；经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.
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| 关 键 词： | 高致病性PRRS N蛋白基因 siRNA 重组伪狂犬病病毒 |
Inhibiting nucleocapsid protein gene expression of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant pseudorabies virus mediated siRNA |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome N protein gene small interfering RNA(siRNA) recombination pseudorabies virus |
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