两种牛蛙活性肽结构及体外抗肿瘤细胞增殖作用的研究

试验旨在研究新发现的两种牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种肿瘤细胞体外增殖的影响,为新的多肽抗肿瘤药筛选提供依据。本试验利用圆二色谱(CD)法检测两种新牛蛙活性肽的二级结构,通过MTS细胞毒试验测定不同浓度的两种新牛蛙活性肽对人肺癌细胞NCI-H446、人乳腺癌细胞MCF-7及小鼠白血病细胞K562 3种瘤细胞体外增殖的影响。圆二色谱法结果显示,Temporin-Lb的二级空间结构为聚脯氨酸Ⅱ型螺旋(PPⅡ)结构,Catesbeianin-1a的二级空间结构为无规则卷曲。MTS细胞毒试验结果显示,给予Catesbeianin-1a的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞形态无明显变化,正常增殖,而给予Temporin-Lb的3种瘤细胞培养24 h后,瘤细胞发生皱缩、细胞变圆、脱落甚至死亡,增殖受到抑制,其中对Temporin-Lb在4~40 μmol/L浓度范围内对小鼠白血病细胞K562的抑制效果最为明显。结果表明,新牛蛙活性肽Temporin-Lb具有一定的抑瘤作用,Catesbeianin-1a对瘤细胞的体外增殖没有明显影响。     

樱桃谷鸭CD3ε胞外区多肽原核表达、抗体制备及初步应用

应用PCR技术从樱桃谷鸭总RNA中克隆CD3ε基因ORF序列(DuCD3ε),通过生物学软件分析,切除信号肤和跨膜区,将胞外区cDNA(DuCD3ε)插入表达栽体pET-28a.构建了E.coli BL21(pET一28a/DuCD3ε)原核表达系.经IPTG诱导表达、蛋白纯化,制备兔抗DuCD3ε多克隆抗体.应用免疫组织化学SABC方法在樱桃谷鸭外周血液涂片上进行初步应用.结果显示,DuCD3ε胞外区序列长252 bp,编码83个氨基酸.SDS-PAGE和Western-blot分析证实重组DuCD3ε(rDuCD3ε)在BL21大肠杆菌中表达.表达蛋白相对分子质量约为14000,经3次免疫后,通过问接ELISA测定兔抗rDuCD3ε蛋白多克隆抗体效价为1:12800.在鸭瘟病毒感染后不同时间,对照组CD3+T淋巴细胞数占淋巴细胞总数的百分比为28%～47%,试验组CD3+T淋巴细胞百分比为32%～77%,在感染后1～3 d外周血液中CD3+T淋巴细胞比值急剧升高,3 d以后比值缓慢下降.结果表明,本试验成功表达CD3ε胞外区多肽,制备的兔抗樱桃谷鸭CD3ε多克隆抗体可用于鸭外周血中CD3+T淋巴细胞标记染色,具有较好的特异性.     

PRRSV特异性肽对CSFV、PRRSV疫苗免疫猪后T淋巴细胞亚群的影响

用猪瘟疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗对猪进行免疫,在免疫后的14d和28d采集外周血液,分析特异性抗体表达量和外周血T淋巴细胞表型的变化,并用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性肽对淋巴细胞进行刺激。结果显示,在PRRSV免疫后14d,机体PRRSV抗体水平较低,其中CSFV低抗组中CD4+细胞百分数明显降低,CD4+/CD8+细胞的比值也明显降低;用PRRSV特异性肽刺激淋巴细胞24h后,CSFV低抗组与高抗组中CD3+、CD8+细胞的百分数都明显升高,CD4+细胞的百分数及CD4+/CD8+细胞的比值都明显降低。在PRRSV免疫后28d,CSFV抗体和PRRSV抗体的产生都比较高,CD3+细胞、CD4+T淋巴细胞百分数及CD4+/CD8+细胞的比值也明显升高,用肽刺激以后,CSFV高抗组中的CD3+细胞百分数降低,CSFV低抗组中的细胞百分数升高,CD4+/CD8+细胞的比值在所有组中均下降。结果表明,PRRSV特异性肽在PRRSV免疫早期可以使CD3+细胞的百分数升高,CD4+/CD8+细胞的比值降低,其详细的机理还有待进一步的探究。     

犬瘟热病毒自然感染犬淋巴组织中T、B细胞变化的研究

为了调查患犬瘟热病犬淋巴组织中T、B细胞变化的特点及淋巴细胞减少的发病机制,试验通过免疫组织化学的方法观察了T细胞(用CD3和CD45RO检测T细胞)、B细胞(用IgG、IgM抗血清检测B细胞)和犬瘟热病毒(抗犬瘟热病毒抗体)在病犬淋巴组织中的分布。结果表明:在淋巴组织中的淋巴细胞、淋巴小结中树突状细胞和巨噬细胞中均检出了抗病毒阳性反应细胞。在骨髓组织的前髓细胞中也发现抗病毒阳性反应细胞和嗜酸性胞浆内及核内包涵体的存在。与对照组相比,CD3和CD45RO阳性细胞主要存在于T细胞的分布域;但CD3和CD45RO阳性T细胞的数量较少。位于淋巴组织中的巨噬细胞有的被CD45RO染成阳性。在B细胞分布的区域中,IgG、IgM阳性细胞的数量明显减少;一些位于淋巴组织的浆细胞也被IgG或IgM染成阳性。在淋巴组织中淋巴细胞减少的顺序为:IgG阳性细胞减少最明显,其次为IgM和CD45RO阳性细胞,再次为CD3阳性细胞。依据试验结果,作者认为病犬淋巴组织中淋巴细胞减少主要是由B细胞缺乏所引起的;淋巴细胞的增殖能力减弱是引起淋巴组织中淋巴细胞减少的重要原因。     

左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞的作用

本文报道了左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞穴PBL雪增殖及伴刀豆球蛋白A穴ConA雪诱导细胞穴CIC雪活性的作用:左旋咪唑以剂量依赖性方式促进鸡PBL的增殖;与ConA对促进鸡PBL增殖呈现协同作用;对脂多糖穴LPS雪激活鸡PBL具有明显促增殖作用;可逆转磷酸组胺和肾上腺素对ConA和LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用;低浓度左旋咪唑不能逆转氢化可的松对ConA激活鸡PBL增殖的抑制作用,但高浓度穴100～400μg/ml雪可明显逆转氢化可的松的抑制作用;左旋咪唑可明显逆转氢化可的松的对LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用;可促进CD+4细胞增殖,抑制CD+8细胞增殖,使CD+4/CD+8细胞比值升高,CIC活性增强。     

四君子汤发酵液的抗肿瘤作用及其对荷瘤小鼠免疫功能的影响

本试验研究了四君子汤发酵液对S180肿瘤模型小鼠的抗肿瘤作用和对免疫功能的影响。采用血清溶血素法检测荷瘤小鼠体液免疫功能;MTT比色法检测淋巴细胞的增殖和流式细胞术检测T细胞亚群。结果表明,四君子汤发酵液具有明显的抑制肿瘤生长的作用,并且可以增强环磷酰胺（CTX）的抗肿瘤作用,降低CTX免疫抑制的副作用。四君子汤发酵液可以提高免疫器官指数;对肿瘤小鼠脾淋巴细胞转化、血清抗体产生都有促进作用;可以明显提高模型小鼠CD3^＋和CD8^＋T淋巴细胞水平,降低由于肿瘤引起的CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞比值的升高,与模型组比较差异显著（P〈0.05）。研究表明四君子汤发酵液的抗肿瘤作用和增强机体免疫调节功能有关。     

左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞的作用

本文报道了左旋咪唑对鸡离体外周血淋巴细胞（PBL）增殖及伴刀豆球蛋白A（ConA)诱导细胞（CIC）活性的作用；左旋咪唑以剂量依赖性方式促进鸡PBL的增殖；与ConA对促进鸡PBL增殖呈现协同作用；对脂多糖（LPS）激活鸡PBL具有明显促增殖作用；可逆转磷酸组胺和肾上腺素对ConA和LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用；低浓度左旋咪唑不能逆转氢化可的松对ConA激活鸡PBL增殖的抑制作用，但高浓度（100-400μg/ml）可明显逆转氢化可的松的抑制作用；左旋咪唑可明显逆转氢化可的松的对LPS激活鸡PBL增殖的抑制作用；可促进CD4^ 细胞增殖，抑制CD8^ 细胞增殖，使CD4^ /CD8^ 细胞比值升高，CIC活性增强。     

抑制性削减技术研究CD3／CD28单抗共刺激人T淋巴细胞基因差异

为了研究参与人T细胞活化、增殖、信号转导的相关基因,以正常人初始T细胞作为对照样本,以抗人CD3抗体联合抗人CD28抗体激发的人T细胞作为试验样本,进行抑制性削减杂交。结果筛选到43个侯选克隆,对其单向测序后,经过与GenBank同源序列比较,证实了6个克隆参与了T细胞活化增殖和信号转导的下游通路,分别为CCND2、RhoA、IRF4、FKSG44、EBP、PRPPS2;13个克隆所可能编码的基因与T细胞活化、分裂增殖、分化有关,另外24个克隆在GenBank无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。对这些基因的进一步研究,有助于阐释T细胞活化、增殖的信号转导机制,为了解体内活化T细胞参与的生理和病理过程,具有一定的指导意义。     

犬骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

为了证明全骨髓贴壁法分离培养犬骨髓间充质干细胞的可行性,为后续移植试验提供活性良好的种子细胞,试验采用全骨髓贴壁法分离纯化犬骨髓间充质干细胞,并通过细胞形态观察、表面标记流式分析、体外诱导分化对细胞进行鉴定。结果表明:分离培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形、集落样生长,表面标记CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性,能够向成骨细胞和心肌样细胞分化。说明全骨髓贴壁法便捷可行,获得的犬骨髓间充质干细胞纯度高,增殖旺盛,分化能力良好。     

CD44、VEGF、p53在犬乳腺肿瘤细胞系中的表达

为了研究犬乳腺肿瘤的转移机制,试验选用从自然发生乳腺肿瘤病例的原发病灶和转移病灶分离培养的4种细胞(CHMp、CHMm、CIPp、CIPm),经传代120代以上、生长性状稳定的细胞系作为研究对象,并对细胞系进行免疫组织化学分析。结果表明:不同细胞系中p53、CD44、VEGF 3种抗体均为阳性反应,但有不同的临床意义;VEGF在4种细胞系中表达无差异,说明在转移组和原发组乳腺肿瘤细胞中功能和作用机理类似;CD44在4种细胞系中的表达均有差异,说明其不能作为独立的预后指标,需要其他因素共同参与调节乳腺肿瘤的浸润和转移;p53在活性和增殖能力最弱的CIPm细胞中表达强度最弱,与组织中的表达结果相符合,说明p53作为动物预后指标是可靠的。     

RNAi沉默接触蛋白-1对犬乳腺肿细胞系CHMm增殖及迁移的影响

为探究接触蛋白-1(CNTN1)对体外培养的犬乳腺肿瘤细胞CHMm增殖及迁移能力的影响,本研究利用RNAi技术沉默CNNT1基因在犬乳腺肿瘤CHMm细胞中的表达,采用CCK8法检测CHMm细胞增殖能力、细胞划痕法检测CHMm细胞迁移能力,western blot检测CHMm细胞中E-cadherin蛋白含量。结果显示CNTN1沉默后,对犬乳腺肿瘤细胞CHMm增殖无明显影响,但能够导致使细胞迁移能力显著减弱,细胞中E-cadherin蛋白含量明显增加。研究表明CNTN1对犬乳腺肿瘤CHMm增殖调节无明显作用,对犬乳腺肿瘤细胞CHMm作用主要是通过降低E-cadherin蛋白的表达增强体外培养的肿瘤细胞迁移力,为犬乳腺肿瘤的治疗提供新的靶点。     

猪瘟免疫猪接种PRRSV Nsp2Δ1882-2241弱毒疫苗后免疫应答及T细胞表型变化特征

选择17头28日龄的CSFV和PRRSV抗体均为阴性的仔猪,于试验的第1天和第14天分别对其进行猪瘟耐热保护剂活疫苗（兔源）和高致病性猪繁殖与呼吸综合征Nsp2A1882—2241弱毒疫苗免疫。在免疫后的第28、42天采集外周血液,分析特异性抗体表达量和外周血T淋巴细胞表型的变化,评估猪瘟免疫对猪繁殖与呼吸综合征免疫的影响。结果显示,在CSF免疫后第28、42天,CSFV高抗组中的CD4^＋、CD4^＋／CD8^＋、CD4^＋CD8^＋和CD4-CD8数目均比CSFV低抗组高,CD3^＋和CD8^＋细胞数量比CSFV低抗组低;PRRS高抗组中,CD4CD8-细胞含量高于PRRS低抗组;在CSF免疫后第28天,CSFV抗体产生较高（阳性比率为73．33％）,PRRSV抗体产生较低（阳性比率仅为6．67％）。在CSF免疫后的第42天,CSF高抗组中PRRSV抗体阳性比率较CSF低抗组高8．33％。结果表明,CSFV特异性抗体产生高时能增加PRRSV特异性细胞免疫应答,增加CD4^＋细胞、CD4^＋CD8^＋细胞数量,提高机体免疫水平。CD3＋和CD4CD8-细胞应答作用值得重视。     

固始鸡免疫器官内T淋巴细胞亚群动态变化

应用流式细胞仪结合免疫荧光抗体技术对固始鸡和固始鸡胚胎免疫器官内T淋巴细胞亚群的动态变化和发育分化规律进行了研究.结果发现,(1)胚胎时期,胸腺内T淋巴细胞发育分化低,表现为成熟的T淋巴细胞(CD3~+)和不成熟的胸腺细胞均较少;出壳后,固始鸡胸腺内成熟T淋巴细胞增多,占胸腺细胞的30%左右,但大部分仍是未成熟的胸腺细胞.(2)脾脏内T淋巴细胞为成熟的T淋巴细胞(CD3~+),占淋巴细胞的60%左右.胚胎时期脾脏内CD3~+水平低,出壳后2周已达脾脏内正常水平(60%左右).(3)法氏囊内有少量的成熟T淋巴细胞(10%左右).结果表明,T淋巴细胞在固始鸡胸腺内增殖分化和成熟,脾脏和法氏囊内的成熟T淋巴细胞均来源于胸腺.     

长春新碱对犬乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

犬乳腺肿瘤在兽医临床中非常常见,母犬乳腺瘤发病率约占全部肿瘤性疾病的25%～42%[1] .其早期治疗主要依靠外科切除的方法,但对已经转移的犬乳腺肿瘤,通过手术切除后也可能复发.为延长患病犬的生命,我们可以选用化疗药物来抑制肿瘤细胞的增殖.长春新碱(vincristine,VCR)是常用的抗肿瘤药物,现已发现可以抑制一些人肿瘤细胞的增殖[2-3],并可以影响一些细胞的周期[4-5].VCR是否对体外培养的犬乳腺癌细胞有抑制作用,国内还未见有这方面的报道,为此,我们进行了这方面的研究.     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒免疫原性测定

为测定表达犬瘟热病毒(CDV)H基因的重组犬2型腺病毒(CAV-2/CDVLPH)免疫原性,25只45-50日龄犬(抗CDV中和抗体小于1∶2,CAV-2 HI抗体效价小于1∶2)随机分为5组进行免疫犬试验,第1组为CAV-2/CDVLPH免疫组,第2组为pVAXLPH免疫组,第3组为pVAXLPH和CAV-2/CDVLPH联合免疫组,CDV弱毒疫苗组和pVAX1空载体组分别作为阳性和阴性对照组。利用间接ELISA和CDV中和试验检测免疫犬的抗CDV体液免疫水平、CAV-2 HI试验检测免疫犬的抗CAV体液免疫水平、淋巴细胞转化试验检测免疫犬的抗CDV和抗CAV-2细胞免疫水平,分析CAV-2/CDVLPH的免疫性。结果,能够在各试验组免疫犬血清中检测到抗CDV ELISA抗体和抗CDV中和抗体,同时在第1组和第3组免疫犬的血清中检测到抗CAV-2的HI抗体,免疫犬的外周淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显增殖,第2组的免疫应答水平低于第3组,第1组又高于第3组,但低于CDV弱毒疫苗免疫组,试验表明CAV-2/CDVLPH可同时诱导免疫犬产生抗CDV和CAV特异性免疫,CAV-2/CDVLPH与pVAXLPH相比能诱导犬产生较高的特异性免疫应答,然而低于CDV弱毒疫苗。     

犬瘟热病毒H、F、N基因试验免疫研究

以构建的真核表达载体pVAXLPH、pVAXLPF和pVAXLPN为基因疫苗,分组进行了免疫小鼠试验,对免疫鼠体内免疫应答水平进行了检测。结果显示:所构建的基因疫苗可以诱导小鼠产生特异性免疫应答反应,pVAXLPH pVAXLPF pVAXLPN 3个基因混合免疫小鼠诱导产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答,免疫3次后血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.332,而免疫前为0.158;抗CDV中和抗体效价为1∶(4~16);CD4 T/CD8 T比值为2.05±0.38,而对照组为1.99±0.56;免疫小鼠脾细胞对CDVLP及ConA刺激的增殖反应值分别为0.384和0.356。基因疫苗免疫犬试验中,进行了单用基因疫苗免疫和基因疫苗与CDV弱毒疫苗联合免疫效果的比较研究。结果显示,基因疫苗免疫3次后,血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.296,抗CDV中和抗体效价为1∶(8~32)。基因疫苗免疫2次,再使用弱毒疫苗加强免疫1次,血清中抗CDV ELISA抗体效价为0.433,抗CDV中和抗体效价为1∶(16~64)。     

银杏叶提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响

为分析银杏叶提取物(EGB)对小鼠脾淋巴细胞体外增殖和分泌功能的影响。无菌分离小鼠脾,制备淋巴细胞,并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养,在培养液中分别加入刀豆蛋白A(Con A)或脂多糖(LPS)及8、16、32和64μg/m L不同质量浓度的EGB,经过不同时间培养后,采用MTT法检测淋巴细胞的增殖,ELISA法检测淋巴细胞分泌IL-4和IL-12的水平,流式细胞仪检测淋巴细胞的细胞周期和细胞膜表面标志。结果表明:EGB能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖,不能与Con A或LPS协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖;能增强IL-4和IL-12的分泌;能提高小鼠脾淋巴细胞CD4~+/CD8~+的比值;能提高脾淋巴细胞周期中细胞进入S期细胞的百分率。结果提示:EGB能增强小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性。     

甲哨唑对鸡细胞免疫和体液免疫功能的作用

本试验观察了甲硝唑对鸡细胞免疫和体液免疫功能的作用，并与左旋咪唑进行了比较。结果表明2．5－400mg/kg甲哨唑可显著促进鸡外周血T淋巴细胞增殖，但对B淋巴细胞无明显影响；可使CD4^ /CD8^ 淋巴细胞比值明显升高；可使鸡外周血淋巴细胞诱生IL－2活性明显增强；可使鸡体内抗颗粒性胸腺依赖性抗原SRBC抗体滴度、抗可溶性胸腺依赖性抗原BSA抗体滴度和抗非胸腺依赖性抗原BA抗体滴度明显升高；可使鸡血清总补体活性明显升高。与甲硝唑比较，左旋咪唑也存在着非常类似的作用，2．5－10mg/kg左旋咪唑可明显促进外周血T淋巴细胞增殖，可使CD4^ /CD8^ 淋巴细胞比值明显升高；可使鸡外周血淋巴细胞诱生IL－2活性明显增强；可使鸡体内抗SRBC抗体滴度、抗BSA抗体滴度和抗BA抗体滴度均明显升高；10mg/kg左旋咪唑甲硝唑可使血清补体总活性升高。上述结果表明甲硝唑和左旋咪唑两种咪唑类化合物在促进鸡细胞免疫和体液免疫可能存在着相似的作用机制。     

抗猪大肠杆菌卵黄抗体变化规律及在体外对大肠杆菌生长的影响

试验研究抗猪大肠杆菌卵黄抗体变化规律及在体外对大肠杆菌生长和对肠黏膜细胞上粘附的影响。试验选用 30周龄海兰褐壳蛋鸡 2 4 0只 ,试验时间 80d。以K88、K99和 987P 3种大肠杆菌混合液为免疫原 ,免疫原中K88、K99和 987P的细菌数分别为 2 .5× 10 9、2 .5× 10 9、2 .5× 10 10 CFU/mL。免疫剂量为 0 .5、1.0、1.5、2 .0mL/只 ,在试验鸡胸腹部肌肉、分多点注射 (每点约 0 .2mL) ,每个免疫剂量免疫健康蛋鸡 5 0只 ,4 0只蛋鸡作对照 ,以个体为单位 ,每天收集鸡蛋 ,4℃保存。在每次免疫 5d后 ,翅静脉采血、分离血清 ,- 2 0℃保存。用盐析法和冷冻干燥法制备抗猪大肠杆菌卵黄抗体粉 ,配制不同蛋白含量的卵黄抗体溶液 ,用体外法研究卵黄抗体对大肠杆菌生长及对肠黏膜细胞粘附的影响。试验结果表明 :最佳免疫剂量为 1.0mL/只 ,卵黄与血清中的抗体水平没有差异 ;在大肠杆菌培养液中 ,添加蛋白含量为 0 .5mg/mL抗猪大肠杆菌卵黄抗体溶液时 ,大肠杆菌的生长受到抑制 (P <0 .0 5 ) ,不同卵黄抗体间没有交叉反应 ;蛋白含量为 0 .2 5mg/mL的抗猪大肠杆菌卵黄抗体溶液对大肠杆菌在肠黏膜细胞上的粘附有抑制作用 (P <0 .0 5 )。     

白细胞介素-2的研究进展与应用

白细胞介素-2又称T淋巴细胞生长因子,是T淋巴淋巴细胞受抗原刺激后所分泌的具有免疫调节作用的淋巴因子.白细胞介素-2除了能在体外维持T淋巴细胞长期增殖与分化外,还具有增强自然杀伤细胞的杀伤活性及促进B细胞分化与增殖的能力,以及诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)产生等重要生物学作用.研究发现,白细胞介素-2在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗等方面具有重要作用.