广东等五省区猴场实验猴血清T淋巴细胞趋向性病毒1型抗体检测分析

为调查广东等地实验猴养殖场猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(Simian T-lymphotropic virus 1,STLV-1)的流行情况,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对采集自广东、广西、云南、海南以及河南境内主要猴场的752份实验猴血清样本进行...     

野生猕猴STLV-1和B病毒抗体的检测

为了调查保护区野生猕猴是否感染猴的3种主要病毒,从广西某自然保护区一只濒死的野生猕猴抽取血液分离血清,分别应用猴3种病毒斑点酶免疫检测试剂盒检测,结果猴T淋巴细胞白血病病毒1型(STLV-1)和猕猴疱疹病毒I型(B病毒)抗体呈阳性,而猴免疫缺陷病毒抗体呈阴性.     

猴T淋巴细胞白血病病毒重组蛋白抗原的构建以及抗原性的检测

灵长类T淋巴细胞白血病病毒(PTLV)包括人类T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)、猴T细胞淋巴细胞白血病病毒1型(STLV-1)、HTLV-2、STLV-2、STLV-L型(STLV-L)以及新发现的STLV-3.STLV-1属于C型逆转录病毒,在核酸序列上与HTLV-1有90%-95%的同源性,并且可能与部分猕猴的恶性肿瘤有关.     

中国3种旧大陆猴TRIMCyp嵌合基因的存在状况及基因特性研究

本研究应用PCR方法检测了中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)的TRIMCyp嵌合基因型个体的存在状况,并首次发现携带TRIMCyp嵌合基因中国品系恒河猴。同时本实验应用建立RT-PCR方法在mRNA水平上进一步检测了恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp嵌合基因序列和特性。其编码的融合蛋白TRIMCyp丧失了对HIV-1复制的限制功能,推测具有该基因型旧大陆猴对HIV-1更易感,可用于建立新型的艾滋病非人灵长类动物模型。本研究结果将促进逆转录病毒跨种间传播的研究和建立HIV-1易感非人灵长类动物模型。     

3种方法检测禽网状内皮组织增殖病毒人工感染鸡胚孵化雏鸡的带毒比较

为比较血液和粪便等样品采用不同方法检测禽网状内皮组织增殖病毒（REV）的准确率,从而为制定禽网状内皮组织增殖病（RE）净化程序提供参考,利用鸡胚卵黄囊接种构建REV垂直传播感染雏鸡模型,分别采用DF-1细胞病毒分离、RT-PCR检测和荧光定量RT-PCR检测,对1日龄雏鸡血液和胎粪样品,7～70日龄鸡（每隔1周）的血液和泄殖腔棉拭子样品,进行REV检测和结果比较。结果显示：对1日龄出壳的SPF鸡血浆进行检测,荧光定量RT-PCR灵敏度最高,阳性检出率为100%(25/25),其次为病毒分离,阳性检出率为96%(24/25),RT-PCR检出率最低;对1日龄出壳的SPF鸡胎粪进行检测,荧光定量RT-PCR与病毒分离灵敏度一致,阳性检出率均为80%(20/25),RT-PCR检出率最低,为28%(7/25)。对7～70日龄鸡（每隔1周）进行血液和泄殖腔棉拭子检测,3种方法阳性检出率与1日龄检测情况总体相似,检出率从高到低依次为荧光定量RT-PCR、病毒分离和RT-PCR。结果表明,在同一检测时间点使用同一检测方法,胎粪/泄殖腔棉拭子REV阳性检出率基本低于血液检出率。本研究初步比较了不同方...     

禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank发表的禽副黏病毒4型（APMV-4）基因组序列,在保守区域分别设计了特异性RT-PCR引物和荧光探针,初步建立了可用于检测APMV-4的荧光RT-PCR方法。特异性试验表明本方法特异性强,与新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合征病毒（EDSV）等没有交叉反应。灵敏度试验表明本方法的检测下限为1EID50,比常规RT-PCR的敏感度高100倍左右。本研究所建立的荧光RT-PCR方法具有快速、准确、灵敏等优点,可用于APMV-4样品的检测。     

猪流感RT-PCR诊断方法的建立

根据GenBank上发表的多株猪流感病毒（SIV）序列,在保守区域设计1对引物,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了可检测出多种亚型猪源流感病毒的RT-PCR方法。通过对反应产物测序分析,与预期结果相符,证明该方法具有很强的特异性;该方法可以检测出约1个TCID50的猪流感病毒,显示较高的敏感性。通过对12份临床样品进行检测,结果发现：该方法和其他两种方法分离病毒符合率相当。本研究建立的猪流感RT-PCR诊断方法具有高特异性和敏感性,适用于SIV的诊断应用和推广。     

猴嗜T淋巴白血病病毒研究进展

猴嗜T淋巴白血病病毒（simian T-cell lymphotropic virus,STLV）是非特定病原体（SPF）猴必须排除的病毒之一,是非人灵长类动物的一种重要的逆转录病毒,其潜伏期较长,非人灵长类动物感染了这一病毒在很长时间内无明显临床症状。目前,STLV已经遍布全球的非人灵长类,并可分为3种类型。研究证明STLV与非人灵长类动物的T淋巴白血病和淋巴肿瘤有关,其主要传播方式是通过血液传播。作者主要介绍了STLV的病毒学特点、流行及检测方法等的研究进展。     

基于Erns基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪瘟病毒Erns基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪瘟病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对CSFV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪瘟病毒检测的灵敏性为10 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒（BRV）与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的双重RT-PCR方法。应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp。说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究。     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

蜜蜂囊状幼虫病RT-PCR快速检测方法的初步应用

蜜蜂的囊状幼虫病是中华蜜蜂常见且为害严重的疾病,病原为小正链RNA病毒。实验通过RT-PCR的方法检测出了该病毒,经序列测定发现与广东的蜜蜂囊状幼虫病毒基因序列有所差别,推测可能是由于地区和蜜蜂种类差异导致的。     

四川省东方蜜蜂病毒病感染状况调查

为了解四川省东方蜜蜂主要病毒病:蜜蜂黑王台病毒(BQCV)、畸翅病毒(DWV)、囊状幼虫病毒(SBV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)的感染状况。采用RT-PCR方法对来自四川省9个地区共270份东方蜜蜂样品进行快速病原学检测。调查结果显示:四川省东方蜜蜂群中有5种病毒的感染;其中,BQCV总阳性率为17.8%,KBV总阳性率为3.0%,SBV总阳性率为1.1%,ABPV总阳性率为1.9%,CBPV总阳性率为2.2%。在被调查的9个地区中,有7个地区蜂群存在至少1种以上病毒病感染的现状,表明四川省东方蜜蜂群疾病感染状况较为严重,其对养蜂业可持续发展的潜在危险需要给予充分关注。     

猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RTPCR检测方法的建立及临床应用

本研究建立了可同时检测猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TransmissiblegastroenteritisVirus,TGEV）、A群轮状病毒（GroupArotavirus,GARV）和猪嵴病毒（Porcinekobu—virus）的多重RT—PCR方法。检测中,建立的多重RT—PCR方法能够检测到500Pg的TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒等量混合RNA模板,与常规的单一RT—PCR检测结果基本相同（检测TGEV、PEDV、GARV和猪嵴病毒的灵敏性分别为1000A、1000／6、93．33％和96．67％,特异性均为i00％）。结果表明,建立的多重RTPCR方法敏感性和特异性良好,可作为临床上猪病毒性腹泻病因快速、高效的诊断工具。应用该方法对2010—2012年华中地区190份腹泻仔猪样本进行检测,PEDV、TGEV、GARV和猪嵴病毒的阳性率分别为62．11％、0．53％、7．37％和82．11％。混合感染方面,PEDV和猪嵴病毒混合感染率为47．89％,PEDV和GARV混合感染率为4．74％,GARV和猪嵴病毒混合感染率为7．37％,PEDV、GARV和猪嵴病毒混合感染率为4．74％,未发现TGEV与其它3种病毒的混合感染情况。另外,有27份样本中仅检出PEDV（14．21％）,57份样本只检出猪嵴病毒（30％）。分析表明,我国自2010年底大面积暴发的病毒性腹泻是多病原混合感染造成的,主要病原为PEDV,猪嵴病毒在其中所起作用尚待进一步验证和研究。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。     

三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪呼吸道冠状病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法建立与应用

本研究根据Genbank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和S基因保守区序列设计合成了两对引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测TGEV的方法。该方法能有效地鉴别序列密切相关的猪传染性胃肠炎病毒与呼吸道冠状病毒。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3个小时以内,具有很好的特异性和重复性。通过对39份临床样品进行检测,结果表明所建立的检测方法直接检测样品中猪传染性胃肠炎病毒。     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。