三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

三角帆蚌CAT基因cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)首次克隆了三角帆蚌过氧化氢酶(CAT)基因的cDNA全长序列,为2 804 bp,包含112 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),1 303 bp的3′UTR和1 388 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)。ORF区共编码462个氨基酸,推算的分子量约为52.7 ku,理论等电点为6.35。多序列比对结果显示,有一段CAT氨基酸高度保守的催化位点序列FDRERIPERVVHAKGAG。三角帆蚌CAT基因有12个与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合的氨基酸残基,分别是Asp107、His153、Phe157、Ser160、Arg162、Asn172、Try174、Lys196、Val261、Trp262、His264和Try317,其中第261位和第264位的氨基酸在不同物种间有所区别。比对结果得到的三角帆蚌CAT基因的氨基酸序列,与软体动物的CAT基因相似性高达99%,与虾类、鱼类、两栖类、哺乳类的CAT基因相似性也达到98%~99%,可推断属于CAT3。利用CAT基因推断得到的氨基酸序列构建NJ系统树,分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,再与虾类聚在一起,然后依次与鱼类、两栖类和哺乳类聚在一起。荧光定量结果显示,CAT基因在三角帆蚌的7个组织均有表达,其中在肾中的表达量极低,在血液中表达呈上调趋势且明显区别于其他组织,在另外5个组织中总体上呈现不统一的先上调后下调的趋势。     

巴夫杜氏藻1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因的克隆和分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中的一个关键酶,其小亚基rbcS具有调控羧化反应催化效率和影响该酶对二氧化碳/氧气底物特异性的功能。从巴夫杜氏藻中克隆rbcS基因及其5′-上游序列,并对基因及5′-上游序列进行了分析。根据已知rbcS基因保守核苷酸序列设计引物,分别克隆到1 841 bp的DNA和380 bp的cDNA序列。以此为基础,使用染色体步移(Genome walking)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,获得了799 bp的5′端DNA序列和500 bp的3′端cDNA序列。序列分析发现,巴夫杜氏藻rbcS DNA全长为2 031 bp(不包括476 bp 5′-上游序列),cDNA全长包括570 bp开放读码框(GenBank登录号:HQ315783)和294 bp 3′端非翻译区。5′-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。该研究旨在为后继的rbcS 基因的功能和表达研究、Rubisco的遗传改造奠定基础。同时,rbcS启动子因其可驱动基因高效表达而引起广泛关注,因此获得的rbcS 5′-上游序列经验证和优化后,可用于在嗜盐微藻中驱动转基因的高效表达以及完善微藻转化系统。     

缢蛏IGFBP基因结构及生长性状相关SNP筛选

类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)是IGF系统的一部分,主要参与IGF的运输、定位和生物活性调节。本研究采用RACE技术和长PCR技术,克隆了缢蛏IGFBP基因的cDNA和DNA全长序列,应用荧光定量PCR技术分析了缢蛏不同发育时期和不同组织中IGFBP mRNA的表达特征,并进一步筛选了IGFBP基因与生长性状相关的SNP位点。序列分析表明,缢蛏IGFBP cDNA序列全长631 bp,包括5'端非编码区60 bp,3'端非编码区136 bp和开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸。该基因含有保守的IGFBP-N端,包含12个半胱氨酸残基,其中1～18个氨基酸为信号肽,属于分泌型蛋白。IGFBP DNA全长3 122 bp,其中包含1个内含子(2 687 bp)和2个外显子(200和235 bp)。荧光定量PCR结果显示,IGFBP mRNA在消化腺组织中表达量最高;在缢蛏的稚贝期,IGFBP mRNA呈现高表达,而在其他发育时期表达量低。在IGFBP基因中筛选到4个SNP位点,其中1个SNP位点与缢蛏的壳长和体质量呈显著相关。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

仿刺参铁蛋白ferritin基因的序列分析及表达

通过构建仿刺参cDNA文库,获得铁蛋白全长cDNA序列。该基因序列全长792 bp,5′非翻译区长133 bp,开放阅读框长522 bp,编码173个氨基酸,3′UTR长137 bp;预测蛋白分子量为20 ku。5′UTR具有一个高度保守的铁离子应答元件。仿刺参ferritin氨基酸序列具备脊椎动物ferritin的亚铁氧化酶活性中心所特有的保守结构。该序列与海参的同源性最高,达84%,与其它无脊椎动物如:海星、鲍、牡蛎、海葵、线虫、小龙虾和果蝇的同源性为74%~34%;与脊椎动物ferritin重链亚基同源性高于轻链亚基。系统进化分析表明,仿刺参的ferritin与大部分无脊椎动物聚为一支。利用半定量RT-PCR检测,ferritin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体、稚参11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均表达。Quantitative real-time PCR结果显示, ferritin mRNA在未受精卵至原肠期表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量显著增高;在幼参的不同组织中,ferritin mRNA在呼吸树中的表达量显著低于其他3种组织;幼参注射LPS后,4种组织中ferritin mRNA表达量与注射前无显著差异。     

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。     

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶 A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H⁺/K⁺-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...     

鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA全长的克隆与表达特征

为探明鱼类消化液分泌的相关调控因子,采用RACE技术分别克隆了鳜(Siniperca chuatsi)两种肠道激素——胃泌素(gastrin,GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)基因的cDNA序列。鳜GAS基因cDNA全长581 bp,5′非翻译区长100 bp,3′非翻译区长145 bp,开放阅读框长336 bp,编码111个氨基酸;鳜CCK具有2种类型:CCK1与CCK2,CCK1 cDNA全长为843 bp,5′非翻译区长60 bp,3′非翻译区长369 bp,开放阅读框414 bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846 bp,5′非翻译区长112 bp,3′非翻译区长332 bp,开放阅读框403 bp,编码134个氨基酸。鳜GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明,鳜GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明GAS与CCK同为消化调控因子,而CCK还是神经分泌因子。鳜GAS与CCK mRNA表达贯穿于整个幼体早期发育阶段(孵化后0～22 d),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。     

海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

鲈3种视黄醇类X受体基因cDNA的克隆和组织表达

视黄醇类X受体(retinoid X receptor,RXR)属于配体激活的核受体家族,在调节细胞内各种信号途径中起重要作用.采用RT-PCR和RACE技术,分离到鲈RXR基因3种亚型RXRα、RXRβ和RXRγ的cDNA序列.结果表明,得到的RXRα是长度为1 686 bp 3′末端不完整的cDNA序列,其中包括364 bp的5′非翻译区和1 322 bp的编码序列,可编码440个氨基酸.RXRβ cDNA全长为1 741 bp,其中包括150 bp的5′非翻译区,256 bp的3 ′非翻译区和1 335 bp的开放阅读框,共编码444个氨基酸,理论分子量为49.5 ku.RXRγ cDNA全长为1 847 bp,其中5′非翻译区为88 bp,3 ′非翻译区为397 bp,开放阅读框为1 362 bp,共编码453个氨基酸,分子量约为49.9 ku.氨基酸序列分析显示,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ和其它物种的RXRs结构类似,在DNA结合区有P box和D box结构,配体结合区包括12个α螺旋和2个β折叠结构,H12的C端含有AF-2的激活区.系统进化树分析表明,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ分别与其他动物的相应亚型聚类.组织分布特异性研究表明,鲈RXRα在肌肉、心脏、眼、大脑、肠、肾脏、脂肪、脾脏、鳃和肝脏10种组织中均有表达,但表达量较低；RXRβ在这10组织中都有较高表达,但心脏中表达量较低；在所检测的10种组织中,RXRγ都有表达,在肌肉、肠、肾脏、脂肪和脾脏表达量较高.     

牙鲆胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1 cDNA全长的克隆及表达分析

利用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条鰤、黄金鲈、红点鲑、鲤鱼和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-PCR分析表明,牙鲆IGFBP-1基因存在母源转录本,合子基因在孵化前的胚胎阶段及早期仔鱼中仅有较低水平的表达,在后期仔鱼中表达逐渐增高;牙鲆IGFBP-1基因在肝脏中表达量最高,在胃、脾、肠、性腺、肾、鳃、脑、心脏和肌肉中也有不同程度的表达。     

梭鲈GH基因序列特征及其在生长差异个体间的表达分析

本研究旨在克隆梭鲈(Sander lucioperca)生长激素(growth hormone, GH)基因, 探究其序列特征及其表达量与梭鲈生长的相关性, 以期为梭鲈生长的分子机理研究鉴定基础。研究采用 RACE 技术从梭鲈垂体中克隆了 GH 基因, 其 cDNA 全长为 926 bp, 包含 74 bp 的 5′非翻译区、237 bp 的 3′非翻译区和编码 204 个氨基酸的开放阅读框。 氨基酸多重比对发现, 梭鲈 GH 与黄金鲈(Perca flavescens)、河鲈(Perca fluviatilis)的氨基酸序列相似性分别为 97.04%和 94.05%, GH 基因在鱼类和哺乳动物中都存在四个保守的半胱氨酸残基位点。应用实时荧光定量 PCR 技术分析了 GH 基因在梭鲈各组织和体重极端差异个体间的表达特征, 结果显示, GH 基因在梭鲈各组织中均有表达, 垂体中相对表达量最高, 脑次之, 与其他组织相比差异极显著(P＜0.01)。GH 基因表达量与梭鲈体重呈正相关, 4 个组织中 GH 基因表达量均为体重极大组高于极小组, 其中垂体和脑中差异极显著(P＜0.01), 肌肉中差异显著 (P＜0.05)。因此, GH 基因可以作为梭鲈生长候选基因用于分子选择。本研究结果可为进一步解析 GH 基因调控梭鲈生长发育的分子机制研究提供参考。     

缢蛏2-CRD型半乳糖凝集素(Galectin)基因的克隆和表达分析

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1 282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF) 918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集素含1个糖识别结构域(CRD)不同,ScGL具有2个CRD。相似性分析显示,ScGL与其他软体动物的半乳糖凝集素具有较高的相似性,与菲律宾蛤仔相似性最高,达65%;与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性分别为39.74%和44.76%。系统进化上ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达,分子量约34.4 ku。荧光定量PCR分析显示,ScGL在缢蛏鳃、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和内脏团中均表达;其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高,出水管和入水管中表达量最低。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌感染后3 h和48 h显著高于对照组;鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6 h和48 h显著高于对照组,说明ScGL参与了病原体诱导的缢蛏免疫应答。本研究为深入探索ScGL在缢蛏免疫中的作用奠定基础。     

虾夷扇贝肌动蛋白基因cDNA序列克隆与分析

采用RT-PCR和RACE法从虾夷扇贝闭壳肌中分离和克隆了肌动蛋白基因cDNA全长序列.肌动蛋白基因cDNA全长1775 bp(不包括poly A),5′端非编码区94 bp,3′端非翻译区551 bp,阅读框1131 bp,编码376个氨基酸.在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第42和第43个氨基酸之间,长度为2041 bp.系统发育分析显示该肌动蛋白属于α类型.     

罗氏沼虾GLUT1基因克隆及其在血糖稳态调节中的功能

为了探究葡萄糖转运蛋白 1 (glucose transporter type 1, GLUT1)在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)糖代谢调控中的作用, 本研究采用 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)克隆获得罗氏沼虾 Mr-GLUT1 基因全长 cDNA 序列, 该基因全长 1929 bp, 开放阅读框(open reading frame, ORF) 1446 bp, 编码 481 个氨基酸, 分子量为 52035.73, 等电点为 6.76。多序列比对及系统进化树分析结果显示, 十足目 GLUT1 基因具有较高同源性, 均存在 12 个跨膜结构域, 罗氏沼虾 GLUT1 与对虾首先聚为一支, 表明亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 结果显示, Mr-GLUT1 在罗氏沼虾各组织均有表达, 肠道表达量最高。葡萄糖注射后, 罗氏沼虾血淋巴葡萄糖水平、肝糖原和肌糖原含量迅速升高, 肠道、肝胰腺和肌肉组织 Mr-GLUT1 基因表达显著上调, 但 Mr-GLUT1 基因表达变化时间延迟于葡萄糖含量的变化。RNA 干扰沉默罗氏沼虾体内 Mr-GLUT1 基因表达后, 血淋巴中葡萄糖和海藻糖含量显著上升。研究表明, Mr-GLUT1 基因可能参与罗氏沼虾血糖稳态调节, 在葡萄糖和海藻糖转运过程中发挥重要作用。     

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×10⁶ cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E值＜10^-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5′-UTR为57 bp,3′-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88~104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69~87处有典型的“ZnFC2H2”结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。     

剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)全长cDNA的克隆及表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法,克隆获得剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)基因的全长cDNA序列。剑尾鱼Vg C基因cDNA序列全长4 011 bp,其5′非编码区包含12 bp和3′非编码区包含246 bp;含有一个3 753 bp的开放阅读框(ORF),编码1 250个氨基酸,推测其编码氨基酸分子量大小为141.7 ku,编码氨基酸序列与其他鱼类卵黄白原C编码氨基酸序列相似性在44%～85%。荧光定量PCR结果显示,Vg C在剑尾鱼肝脏中表达量最高,脾、肾、卵巢中有微量表达,脑、肌肉、鳃中几乎没有检测到表达;对不同时间暴露在雌激素中剑尾鱼肝脏进行实时荧光定量PCR表达分析的结果表明,Vg C在剑尾鱼肝脏中第5天表达量最高,随后降低,第9天后维持相对较低的表达量。研究首次克隆了剑尾鱼Vg C基因全长cDNA序列,并对Vg C在剑尾鱼体内表达组织器官分布及雌激素诱导后不同时间表达谱进行了初步研究,为剑尾鱼生殖生理及环境污染物监测应用等不同领域研究打下重要基础。     

鳡肌肉生长抑制素(MSTN)基因的克隆及其组织特异性表达分析

以鳡肌肉总RNA为模板,采用RTPCR和RACE的方法,获得了鳡肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的3个重叠片段,测序后拼接得到2 177 bp全长cDNA序列,其包含了5′端非翻译区的89个核苷酸和3′端非翻译区1 052个核苷酸以及1 125个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸,其中前22个氨基酸为鳡MSTN的信号肽。鳡MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和在C端生物活性区含9个保守的半胱氨酸残基。核苷酸和氨基酸同源性分析发现鳡MSTN与厚颌鲂、草鱼和鲤等鲤形目鱼类的同源性较高,与鲈形目的同源性较低,与哺乳动物和鸟类的同源性最低;系统发育分析表明鳡MSTN与厚颌鲂亲缘关系最近。 半定量RT-PCR分析表明,该基因在肌肉和脑中表达量最高,在心肌中也有较高表达,在肝脏、肠、鳃和肾等组织中未见明显表达,此结果表明鳡MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能。