海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...