剑尾鱼卵黄蛋白原基因片段克隆、表达及蛋白检测方法的建立

本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法.根据已发表的底鳉(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1 118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底鳉和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%.在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白.表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后,SDS-PAGE分析有29 kD的表达蛋白产生,与预期相符.以重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清.雌激素(β-雌二醇)对剑尾鱼诱导后,用重组蛋白抗血清作一抗,进行Westernblot分析.结果表明,该抗血清能与剑尾鱼卵黄蛋白原特异结合,可应用于剑尾鱼卵黄蛋白原的检测.卵黄蛋白原是环境雌激素研究中较为特异、灵敏的生物标志物,剑尾鱼卵黄蛋白原检测方法的建立,为剑尾鱼环境监测应用提供良好基础.     

剑尾鱼 2 种卵黄蛋白原全长 cDNA 的克隆及序列分析

卵黄蛋白原是环境雌激素效应研究的重要生物标志物,广泛应用于水环境内分泌干扰物污染的评价。本研究利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆获得了剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的2种卵黄蛋白原基因—VgA和VgB,并对其基因结构和系统进化进行分析。VgA基因cDNA序列全长5159bp,开放阅读框(ORF)5058bp,编码1685个氨基酸。VgB基因cDNA序列全长5349bp,开放阅读框(ORF)5067bp,编码1688个氨基酸。2种cDNA序列均具有与已发现的卵黄蛋白原分子相似的主要特征和功能域,包括Vitellogenin结构域、VWFD结构域和多聚丝氨酸区域,且与已知其他鱼类卵黄蛋白原基因有较高的同源性。     

卵黄蛋白原在剑尾鱼体内不同组织的分布及雌激素作用对其表达的影响

为研究卵黄蛋白原(vitellogenin,vg)在剑尾鱼(Xiphophorus helleri)不同组织器官的表达情况,以及了解雌激素对不同组织中Vg表达的诱导作用,将成年雌、雄剑尾鱼及幼鱼暴露于50 μg/L的17β-雌二醇(E2)溶液中20 d,未暴露的剑尾鱼作对照,采用免疫组化法对各处理组剑尾鱼进行Vg的组织定位研究.结果表明,剑尾鱼Vg主要分布于成熟雌鱼的肝脏、脾脏和肠的血管、淋巴管,在正常幼鱼及雄鱼的以上各组织中均不表达.17β-雌二醇暴露下,剑尾鱼雌、雄成鱼和幼鱼的肝脏以及肾、脾、肠等组织的血管及淋巴管均呈Vg阳性.但Vg颗粒只在肝实质细胞中观察到,在其他组织中如脾脏、肠固有结缔组织等,Vg颗粒仅出现于血管,在细胞内未观察到.以上结果表明,剑尾鱼Vg在肝细胞中合成,通过血液循环到达其他组织;雌激素可诱导雌、雄剑尾鱼及幼鱼肝组织中Vg的表达.剑尾鱼幼鱼及雄鱼Vg的非正常表达可应用于环境雌激素效应评价.     

剑尾鱼卵黄脂磷蛋白的纯化及免疫分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱和HiTrap Q阴离子交换柱从卵黄生成期的雌性剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白(Lv)。已确定被纯化的剑尾鱼Lv在Native-PAGE(4%~7.5%)电泳中分子量为530 kD左右。Native-PAGE(4%~7.5%)电泳后的凝胶分别进行糖蛋白染色、脂蛋白染色及磷蛋白染色。结果表明,剑尾鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白。用纯化的剑尾鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。用免疫双扩散的方法测定Lv抗血清的效价为l∶32。Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好;卵黄蛋白原(Vtg)和Lv抗血清之间存在明显的免疫交叉反应,表明Vtg和Lv两者具有相同的免疫原性。免疫双扩散检测表明,抗Lv血清表现出明显的雌性特异性和种的特异性。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

克氏原螯虾卵黄蛋白原受体cDNA部分序列的克隆及mRNA表达量的相对定量

从成熟的克氏原螯虾卵巢中提取总RNA,通过同源克隆得到了卵黄蛋白原受体c DNA部分序列,长度为506 bp,在NCBI网站上进行比对后发现,其与斑节对虾、短沟对虾、罗氏沼虾的卵黄蛋白原受体(Vg R)c DNA序列有较高的相似性。采用实时荧光定量PCR方法,测定了卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两个组织中卵黄蛋白原受体m RNA的相对表达水平。结果显示,卵巢是卵黄蛋白原受体基因表达的主要部位,而肝胰腺只能检测到少量表达,卵黄蛋白原受体基因在卵巢的卵原细胞增殖期相对表达量最高,随后下降,成熟期达到最低值,恢复期开始回升。结合卵巢不同发育阶段卵巢质量的变化计算表达总量,结果发现,卵黄蛋白原受体基因的表达总量在卵原细胞增殖期为最低,随后持续升高并至成熟期达到峰值,恢复期急剧下降,但仍略高于卵原细胞增殖期的表达量。此外,运用所构建的系统进化树比较了克氏原螯虾Vg R m RNA与其他物种间的遗传距离。     

大鳍鳠免疫球蛋白轻链3型基因cDNA的克隆及表达

应用同源克隆和RACE-PCR方法获得大鳍鳠免疫球蛋白轻链3型(IgL3)基因的全长cDNA序列,并分析了该基因在组织中的表达。大鳍鳠IgL3的cDNA全长为947 bp,包含5非编码区58 bp,3非编码区184 bp,开放阅读框705 bp,编码234个氨基酸。推测的蛋白质序列分为可变区(VL)和恒定区(CL)。VL被进一步划分为4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR)。大鳍鳠与其它6种硬骨鱼类免疫球蛋白轻链L3氨基酸序列比对分析表明,大鳍鳠氨基酸序列与斑点叉尾IgL3型(F型)的相似性最高,为68.8%,与南极鱼IgL3型的相似性最低,为47.2%。进化树分析表明,大鳍鳠IgL与斑点叉尾IgL3型(F型)聚为一支并与其它硬骨鱼类IgL3型聚为一簇,明显与L1和L2进化支不同。实时荧光定量PCR显示,大鳍鳠IgL3基因主要在头肾、脾脏和血细胞中转录表达;注射嗜水气单胞菌后,头肾、脾脏和血细胞IgL3基因转录表达量有显著上升。研究表明,头肾、脾脏和血液是大鳍鳠IgL3型基因主要的表达器官,在免疫反应中起重要作用。     

中国对虾Rab7全长cDNA的克隆及原核表达

本研究采用RACE方法克隆了中国对虾Fenneropenaeus chinensis Rab 7基因(crab7)全长cDNA (GenBank∶JF742050).生物信息学分析显示,fcrab7的开放阅读框615bp,编码205个氨基酸,分子量23.2kD.FcRab7的氨基酸序列具有Rab蛋白家族的共同特征,与凡纳滨对虾和斑节对虾同源蛋白的同源性为100％.构建重组表达载体pBAD/ gⅢA-crab7转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE检测和Western blot验证.本研究结果为进一步研究WSSV与FcRab7的相互作用提供了基础.     

海蜇(Rhopilema esculentum)Notch基因的cDNA克隆和表达

基于转录组454 GS FLX测序结果,利用RACE和RT-PCR技术克隆了海蜇(Rhopilema esculentum) Notch基因的cDNA全长,并分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达差异,以探讨Notch基因对海蜇无性生殖的影响.结果显示,海蜇Notch基因的cDNA全长为6768 bp,包括90 bp的5'非编码区、6066 bp的开放阅读框及612 bp包含AATAAA加尾信号的3'非翻译区.SMART分析表明,海蜇Notch为分泌蛋白,其信号肽由21个氨基酸组成.成熟肽由2000个氨基酸组成,包括37个结构域、26个表皮生长因子样结构域、3个富含半胱氨酸的Notch/Lin-12(NL)结构域、1个NOD结构域、1个NODP结构域、1个跨膜结构域和6个锚蛋白结构域ANK,并含有25个N-糖基化位点.同源分析表明,海蜇Notch与来自刺胞动物门的海葵(Nematostella vectensis)的Notch相似性为39％,与无脊椎动物和脊椎动物的氨基酸相似度分别为35％-37％和34％-38％.RT-PCR分析表明,Notch基因在海蜇无性繁殖的4个发育时期均有表达,螅状体阶段的表达量最高,横裂体阶段表达量最低,螅状体的表达量是横裂体的1.85倍.这些研究结果为进一步研究Notch信号通路在海蜇无性繁殖中的调控作用奠定了基础.     

鳜免疫球蛋白 D 重链基因的克隆与表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜(Siniperca chuatsi)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因的全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358bp,其5l非编码区包含30bp,3l非编码区包含337bp;开放阅读框包含2991bp,编码996个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%～72%之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,鳜mIgD与牙鲆和庸鲽IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示,鳜mIgD的mRNA主要分布于外周血白细胞、胸腺、头肾、中肾和脾脏中。     

剑尾鱼RW-H近交系20个微卫星位点的遗传结构

为了对水生实验动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)RW-H系近交15代的遗传结构进行研究,寻找该近交系的标志基因位点,选择20个在野生剑尾鱼群体具多态性的微卫星位点,对剑尾鱼RW-H系(红眼白体)30尾个体进行分析。结果表明,其中有17个位点为单态,有可能作为该近交系的标志基因位点;另外3个位点Msa012、Msa033和Msc036具有多态性,多态信息含量值分别为0.3047、0.3457和0.3648。通过Pop-gene 3.2软件分析得知全部基因位点的纯合率达到了95.83%,个体间平均遗传距离为0.0482(0.000 0~0.1625),遗传相似系数为0.9518(0.8500~1.0000),说明剑尾鱼RW-H系已经具有很高的近交程度。几个多态性位点的发现,可以指导近交选育,加快选育进度。本研究方法不仅检测出剑尾鱼RW-H系具较低的遗传多样性,而且可为中国建立分子水平的实验动物监测标准提供基础数据。     

中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。     

拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆获得14-3-3基因cDNA全序列.序列分析结果表明:拟穴青蟹14-3-3基因全长1112bp,开放阅读框长744 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为28.086 ku,等电点为4.675.与其他物种14-3-3基因氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹14-3-3基因与斑节对虾14-3-3基因同源性最高(95％),依次为墨吉对虾(93％)、苜蓿切叶蜂(92％).聚类分析表明,拟穴青蟹14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾、墨吉对虾紧密聚为一支.经荧光定量检测,拟穴青蟹14-3-3基因在肝胰腺和肌肉中的表达量较高,其次为鳃、眼柄、心脏和肠,在胃中表达最少.盐度骤变实验结果表明:盐度胁迫24 h后,盐度的下降(5)或者上升(15、20、25、30)都引起了14-3-3基因在鳃中的表达量极显著上升(P＜0.01),盐度变化的幅度越大,14-3-3基因的表达量越多.实验结果为进一步深入研究14-3-3基因的功能及调控机理奠定基础.     

Intercohort cannibalism and post-partum behaviour of juvenile swordtail Xiphophorus helleri Heckel (Pisces: Poeciliidae)

Newborn (i.e. neonate) swordtail Xiphophorus helleri Heckel attempted to escape cannibalization attempts in a downward direction more frequently than in any other direction. The downward escape response is likely to be anti‐predator behaviour. In addition, neonates were often able to escape cannibalization at the time of birth, despite no previous exposure to predators, which suggests that this anti‐predator behaviour is innate. However, neonates at the time of birth were more vulnerable to cannibalism than older juveniles, which supports the hypothesis that anti‐predator behaviour is, at least in part, further developed as a result of previous experience (i.e. learning).     

剑尾鱼脑细胞系的建立及细胞色素P4501A的诱导表达

为了构建剑尾鱼脑细胞系并探讨其细胞色素P4501 a(CYP1A)基因的诱导效应,实验通过胰蛋白酶消化法对剑尾鱼脑组织进行体外培养,经连续继代培养,建立了可稳定传代的脑细胞系,命名为SFB.SFB最适培养液为含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12和L-15等比混合培养液,培养条件为27℃,5％ CO2.生长特性研究表明,第65代细胞的群体倍增时间为43.048h,显示出旺盛的生长和分裂能力.染色体分析发现,培养细胞的染色体众数为48条,SFB核型公式为2n =2st +46t,臂指数(NF) =48,与剑尾鱼一致.诱导实验表明,SFB在10-8～ 10-5 mol/L的苯并(a)芘诱导下,CYP1A mRNA表达量显著提升,且表现出良好的剂量效应关系.脑细胞系的建立为剑尾鱼的毒理学评价研究提供了便利,也为其系统的生态毒理学应用打下基础.     

Intercohort cannibalism and parturition-associated behaviour of adult swordtail, Xiphophorus helleri Heckel (Pisces: Poeciliidae)

The post‐parturition behavioural patterns of adult Xiphophorus helleri (Heckel) were described and quantified by recording their duration and/or frequency in glass tanks. All births occurred in the dark. Female behaviour might increase the chance of newborn juvenile survival: at the top of the tank, where juveniles are more vulnerable to predation, the females gave birth in the artificial refuge, while no parturition took place in the refuge at the bottom. Birth‐giving females were no less cannibalistic than males and other females. There was a reduction in cannibalism and the frequency of secondary attacks with time, even though the number of juveniles in the tank continued to increase due to ongoing parturition. Most adults were found at the bottom of the water column during the first 500 min of parturition, after which they were distributed equally in the water column. The movement of adults, away from the bottom and consequently away from the juveniles corresponded with an increase in feeding on alternative food and a reduction in cannibalism. Thus, cannibalism in swordtail might be opportunistic predation.     

中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

中华绒螯蟹EcR基因全长cDNA克隆及表达分析

为了研究蜕皮激素受体(EcR)在中华绒螯蟹蜕皮和性腺发育过程中的作用,本实验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了中华绒螯蟹EcR基因全长cDNA序列。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮过程及卵巢发育阶段的表达特征,并研究了甲基法尼酯(MF)对卵巢中EcR的调控作用。结果显示,中华绒螯蟹EcR cDNA全长2 156 bp,编码422个氨基酸,其序列与招潮蟹相似性最高,为89%。荧光定量PCR结果显示,EcR在Y器官中表达量最高;在卵巢和肌肉中少量表达;在肝胰腺、鳃、心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中EcR表达量在D期和E期的表达量最高;肝胰腺中EcR表达量从AB期到D期有上升的趋势,到E期有所降低;肌肉中EcR表达量在AB期最高;鳃中EcR表达量在D期最高。在中华绒螯蟹卵巢发育过程中,EcR在卵巢发育Ⅰ~Ⅳ期的表达量有上升趋势,到Ⅴ期表达量降低;体外注射实验中,MF1(注射1μg)组的EcR表达量与对照组和生理盐水组无显著差异,而MF2(注射2μg)组的EcR表达量显著上升;离体培养实验中,MF1组(10-8mol/L)和MF2组(10-7mol/L)显著高于对照组和生理盐水组。研究表明,EcR基因在中华绒螯蟹蜕皮和卵巢发育过程有重要作用,MF可以调控EcR基因在卵巢中的表达。