鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp，5′端非翻译区43 bp，3′端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

稀有■鲫Foxo3a、Foxo3b基因克隆和表达分析

利用RACE技术自稀有■鲫的卵巢中克隆叉头蛋白O3a(Foxo3a）、叉头蛋白O3b(Foxo3b）基因的全长cDNA序列，采用RT-PCR、qRT-PCR和原位杂交法检测其组织分布、时序表达、细胞定位和雷帕霉素处理后的表达。结果显示，Foxo3a基因全长cDNA序列为2562bp，包括242bp的5′端非编码区、367bp的3′端非编码区、1953bp的开放阅读框，编码650个氨基酸；Foxo3b基因全长cDNA序列为2804bp，包括470bp的5′端非编码区、375bp的3′端非编码区、1959bp的开放阅读框，编码652个氨基酸。Foxo3a基因只在脑和卵巢中表达，在其他组织中不表达；Foxo3b基因在所检测的组织中均有表达，在脑和卵巢中的表达量较高。随着卵巢的发育，Foxo3a基因表达量呈逐渐升高的趋势，Foxo3b基因表达量未出现显著变化。原位杂交结果显示，Foxo3a、Foxo3b基因定位于卵巢Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相的生殖细胞和滤泡细胞中。雷帕霉素处理影响了卵巢中Foxo3a基因的表达，对Foxo3b基因的表达无显著影响。试验结果表明，Foxo3a和Foxo3b基因可能在稀有■鲫...     

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

鲈3种视黄醇类X受体基因cDNA的克隆和组织表达

视黄醇类X受体(retinoid X receptor,RXR)属于配体激活的核受体家族,在调节细胞内各种信号途径中起重要作用.采用RT-PCR和RACE技术,分离到鲈RXR基因3种亚型RXRα、RXRβ和RXRγ的cDNA序列.结果表明,得到的RXRα是长度为1 686 bp 3′末端不完整的cDNA序列,其中包括364 bp的5′非翻译区和1 322 bp的编码序列,可编码440个氨基酸.RXRβ cDNA全长为1 741 bp,其中包括150 bp的5′非翻译区,256 bp的3 ′非翻译区和1 335 bp的开放阅读框,共编码444个氨基酸,理论分子量为49.5 ku.RXRγ cDNA全长为1 847 bp,其中5′非翻译区为88 bp,3 ′非翻译区为397 bp,开放阅读框为1 362 bp,共编码453个氨基酸,分子量约为49.9 ku.氨基酸序列分析显示,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ和其它物种的RXRs结构类似,在DNA结合区有P box和D box结构,配体结合区包括12个α螺旋和2个β折叠结构,H12的C端含有AF-2的激活区.系统进化树分析表明,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ分别与其他动物的相应亚型聚类.组织分布特异性研究表明,鲈RXRα在肌肉、心脏、眼、大脑、肠、肾脏、脂肪、脾脏、鳃和肝脏10种组织中均有表达,但表达量较低；RXRβ在这10组织中都有较高表达,但心脏中表达量较低；在所检测的10种组织中,RXRγ都有表达,在肌肉、肠、肾脏、脂肪和脾脏表达量较高.     

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。     

仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷...     

海带cbbX基因序列特征及在雌、雄配子体之间的差异表达

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,分子量为45.26ku,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,它们的剪切位点都遵循GT-AG规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有差异。自编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的Walker ATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列...     

黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。     

黄鳝β－肌动蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT—PCR和RACE法，从黄鳝(Monopterus albus Zuieuw)肝脏中分离和克隆黄鳝β-肌动蛋白(actin)基因。该基因cDNA全长l765bp[不包括poly(A)]，5’端非翻译区12bp，3’端非翻译区有625bp[不包含poly(A)]，阅读框(Open reading frame，ORF)1128bp，翻译成375个氨基酸，蛋白质分子量41．77kD。将所得序列与各科鱼、蛙、鸡、牛、鼠、人等的β-肌动蛋白基因序列同源性分析显示，核苷酸序列具有68％～95％的相似性，氨基酸序列具有97％～100％相似性，显示该基因在生物进化过程中的保守；系统发育分析表明黄鳝β-肌动蛋白基因与罗非鱼的亲缘关系最近。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

不同年龄细鳞鱼的繁育效果

研究了不同年龄组(3～8龄)细鳞鱼(Bachymystax lenok Pallas)亲鱼的繁育效果,分析其繁育主要技术,包括亲鱼培育、繁育技术、受精卵孵化、鱼苗培育等,结果发现,5～6龄和7～8龄细鳞鱼产卵量没有明显差异,产卵量、孵化率、出苗率均较高,繁殖效果明显好于3～4龄亲鱼。     

海口市近海渔业资源衰退的原因分析与对策建议

在分析海口市海洋渔业资源和海洋捕捞现状的基础上，提出了近海渔业资源衰退的6项原因和加快保护和修复资源的10项措施和建议。     

头足类耳石微化学研究进展

耳石是位于平衡囊内起平衡作用的一对钙化组织,它是头足类的加速度感应器,记录其生命周期内的生物和生态信息。随着鱼类耳石微化学研究及应用的日趋成熟与完善,头足类耳石的相应研究也逐渐兴起。目前头足类耳石微化学的研究内容主要包括无机和有机大分子、微量元素、同位素、微化学标记等方面,其中微量元素是应用研究的重点,在头足类种群识别、生活史分析及栖息环境重建等方面发挥了重要作用。分析认为,头足类微量元素在与栖息环境尤其水温关系的研究中取得了很好的结果,被认为是测定头足类生活水温的温度计。然而,涉及种群识别、生活史分析以及与盐度和食物关系的研究还不够充分,且多集中于Sr/Ca的研究。因此,建议在今后的研究中要综合多种研究方法按时间和空间序列从日轮水平分析多种微量元素的含量与变化。