斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体,在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(Pm Toll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型,通过免疫印迹方法证实Pm Toll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处Pm Toll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。q RT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路,促进通路下游髓样分化因子(My D88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达,同时酶联免疫吸附测定结果证明Pm Toll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活Pm Toll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制Pm Toll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过Pm Toll9激活Toll信号通路,引起机体免疫防御反应,而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数估计

该研究以高氨氮和淡水胁迫致死时间为衡量指标,估计了斑节对虾(Penaeus monodon)耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数。以斑节对虾"南海1号"和非洲品系为亲本,建立了27个全同胞家系,含5个半同胞家系。利用单性状动物模型和ASReml软件估计斑节对虾幼体阶段的耐氨氮和淡水应激性状的方差组分和遗传参数。通过最佳线性无偏预测法估计所有个体和家系耐氨氮和淡水应激性状的育种值。斑节对虾耐氨氮和耐低盐的遗传力分别为0.11±0.04和0.29±0.08,且统计检验达到显著水平。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系表型值相关系数为0.15,表现为低度线性正相关。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系育种值相关系数为0.57,表现为中度线性正相关。因此在进行斑节对虾耐氨氮性状选育时,耐淡水应激性状也能得到一定的改良。     

斑节对虾C1q结合蛋白(PmC1qBP)的克隆及表达特征分析

Clq结合蛋白(ClqBP)是补体系统中的一种重要成分,它能与游离的补体分子Clq的胶原样区相互作用并启动多种细胞反应,包括增强吞噬作用、促进吞噬细胞对微生物的杀伤、诱导趋化作用,从而增强生物体的免疫性.本实验从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并克隆了PmClqBP基因.为研究PmClqBP在斑节对虾中的生物学功能,采用半定量和荧光定量的方法研究比较了PmClqBP基因在雌雄个体不同组织及卵巢不同发育阶段的差异表达情况.结果表明:雌雄个体的PmClqBP基因在性腺、胃、血细胞、肠中表达量存在极显著差异(P＜0.01).同时,PmClqBP在无节幼体和蚤状幼体时表达量低,从糠虾幼体至卵巢发育成熟过程中表达量有所增加并趋于稳定,揭示PmClqBP斑节对虾卵巢发育过程的重要功能基因.应激实验结果表明,经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激6h后PmClqBP在肝胰腺中的表达量极显著上调,提示PmClqBP参与了斑节对虾天然免疫应答,暗示其在斑节对虾先天性免疫调控中发挥着重要的作用.     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

恩诺沙星对卵形鲳鲹幼鱼抗氧化酶活性的影响

采用静水法,对恩诺沙星(Enrofloxacin)处理卵形鲳鲹幼鱼肝脏、后肾中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性研究。结果表明,恩诺沙星对肝脏和后肾ACP、CAT、POD、SOD活性有显著诱导作用(P0.05),并且与药物浓度、作用时间有关,为研究恩诺沙星对卵形鲳鲹的作用机理、疾病防治提供参考。     

尖吻鲈尾部骨骼胚后发育研究

运用阿尔新蓝—茜素红分染染色法对尖吻鲈仔、稚鱼(1~20日龄)尾部骨骼发育进行研究。研究表明,在尖吻鲈仔鱼体长为(1.86±0.05)mm时眼睛发育完全、口张开、消化道形成,骨骼开始发育,脊柱出现弯曲,头部与躯干形成139°~149°的夹角;在体长(2.48±0.1)mm时,第一片尾下骨出现;体长(2.58±0.1)mm时,第二片尾下骨和第三片尾下骨同时出现;体长(2.85±0.1)mm时第四片尾下骨、第五片尾下骨和尾下骨旁骨同时出现;体长(3.28±0.1)mm时尾杆骨的上翘逐渐明显,尾下骨变宽,尾杆骨尚未缩短;体长(5.11±0.2)mm时,尾杆骨缩短,尾部骨骼变形完成;体长(10.11±0.5)mm时,胸鳍发育完成,鱼体骨骼发育趋于成熟,变态发育完成。     

尖吻鲈仔鱼骨骼发育观察

[目的]掌握尖吻鲈仔鱼期的骨骼生长发育规律,为开展尖吻鲈骨骼发育相关基因研究及鱼类化石探究提供基础资料.[方法]采用软骨—硬骨双染染色技术,连续观测0~23日龄尖吻鲈仔鱼发育过程中脊柱及附肢骨骼中的胸鳍、背鳍、腹鳍、尾鳍、臀鳍形成及生长发育特征.[结果]1日龄的尖吻鲈全长1.70±0.10 mm,其身体细长笔直,骨骼尚未开始骨化,附肢骨骼未出现;3日龄时,尖吻鲈仔鱼脊索发生自然弯曲并开始发育,胸鳍、尾鳍原基逐渐形成;5日龄时,尖吻鲈仔鱼脊索末端开始向上弯曲,背鳍开始发育;9日龄时,尖吻鲈仔鱼脊索出现弯曲,髓弓和脉弓开始形成,尾杆骨上翘,随之形成尾鳍,胸鳍原基、背鳍鳍皱开始出现,臀鳍开始发育;13日龄时,尖吻鲈仔鱼的胸鳍和尾鳍发育基本完成,髓棘、脉棘开始出现;15日龄时,尖吻鲈仔鱼的腹鳍开始发育,背肋和腹肋以软骨的形式生长,尾杆骨收缩,背鳍和胸鳍进入发育后期;19日龄时,尖吻鲈仔鱼脊柱骨化,胸鳍出现鳍棘,附肢骨骼发育接近完全;21日龄时,尖吻鲈仔鱼的背肋和腹肋开始骨化,尾鳍骨化基本完成,髓弓、脉弓、髓棘和脉棘也开始骨化;23日龄时,尖吻鲈仔鱼脊柱骨化完全,胸鳍发育完成,鱼体骨骼基础框架完成发育,鳍条开始骨化并出现分节,仔鱼完成变态.脊柱畸形首次出现在10日龄的尖吻鲈仔鱼中,至22日龄时畸形率占样本采集总量的8%,其中前期畸形的仔鱼在14~15日龄时基本被淘汰.[结论]尖吻鲈仔鱼脊柱及附肢骨的发育顺序与其他鱼类基本一致,但发育时间节点有所不同.尖吻鲈仔鱼的骨骼发育畸形首次出现在10日龄左右,但主要集中在20~22日龄.     

3种来源的野生斑节对虾携带病毒情况调查

利用PCR方法,对2008年取自3个斑节对虾主产地（中国、泰国、非洲）的野生斑节对虾亲虾进行主要病毒病筛查。在所检测的210例野生亲虾样本中,均发现携带白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）或斑节对虾杆状病毒（MBV）的阳性样本,其中泰国来源的斑节对虾亲虾WSSV携带率最高,达到89.8%,而中国来源的斑节对虾亲虾IHHNV携带率最高,为8.8%。12例样本同时检测出WSSV和IHHNV（阳性率为5.7%）。该结果揭示3种来源的斑节对虾亲虾普遍携带WSSV和IHHNV,其中WSSV仍然是感染斑节对虾的主要病原。调查结果增进了对斑节对虾主产区野生亲虾健康状况的了解,并在一定程度上揭示了WSSV感染的新规律。