饲料添加益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群、Toll受体及溶菌酶基因表达及抗感染的影响

以初体重为(7.20±1.38)g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,在室内养殖箱进行3周的养殖实验和2周的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)人工感染实验,其中对照组每日投喂普通商品饲料,实验组每日投喂在普通商品饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)1.0×10~8 CFU/m L配制成的实验饲料。目的是研究饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群、Toll受体及溶菌酶基因表达量和抗哈维氏弧菌能力的影响。实验结果表明,在饲料中添加地衣芽孢杆菌可显著提高对虾抗哈维氏弧菌感染的能力,其相对免疫保护率为22.22%。与对照组相比,实验组可显著降低对虾肠道内弧菌数量(P0.05)。感染哈维氏弧菌后,实验组溶菌酶(lysozyme,LZM)m RNA的相对表达量在12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h均显著高于对照组(P0.05)。实验组感染哈维氏弧菌后在6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、7 d的Toll受体(Toll receptor)m RNA的相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。实验结果提示:饲料中添加地衣芽孢杆菌可有效提高对虾抗哈维氏弧菌感染的能力,这种能力的提高可能是通过降低对虾肠道内的弧菌量,并提高抗病相关基因的表达量实现的。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5'非编码区(UTR)为89 bp,3'UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P0.01),但在鳃中的表达被抑制(P0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

细胞分裂周期蛋白42(CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷(GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42(Pm CDC42)基因c DNA全长。生物信息学分析结果表明Pm CDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5'非编码区(UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了Pm CDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同p H、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌(Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,Pm CDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在p H和Cd胁迫下Pm CDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下Pm CDC42表达量上调,低盐胁迫下Pm CDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明Pm CDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。     

斑节对虾胸腺素β5的克隆、表达与功能分析

β-胸腺素(β-thymosin)是一类高度保守的功能多肽,在伤口愈合、血管生成、抗菌和抗病毒免疫等生理活动中起重要的调控作用。本研究从斑节对虾(Penaeus monodon)中成功克隆了一种β-thymosin cDNA序列(β-thymosin 5),其全长为1495 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)为615 bp,编码204个氨基酸。多重序列比对和系统进化树分析结果表明Pmβ5与对虾属的日本囊对虾(Penaeus japonicus)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的胸腺素β5聚为一支,其中与日本囊对虾的胸腺素β5同源性最高,相似性高达77%。组织分布研究显示Pmβ5mRNA在肝胰腺和淋巴等免疫相关组织中的表达量明显高于其他组织。在灭活的副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激下, Pmβ5基因的表达量显著升高(P0.05),这说明Pmβ5参与了对虾的抗菌免疫反应。此外,用原核表达技术获得了Pmβ5的体外重组蛋白,抗菌实验(牛津杯法)检测证明, Pmβ5对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和枯草芽孢杆菌均有抗菌活性。     

花鲈irak4基因cDNA的克隆与表达分析

Toll样受体家族信号通路参与了机体特异性免疫和先天性免疫过程,白介素1受体相关激酶4 (IRAK4)是Toll样受体家族信号通路中的重要成员之一。该研究克隆了花鲈(Lateolabrax maculatus) lmirak4序列,并分析了其序列特征、表达模式及亚细胞定位。Lmirak4基因cDNA开放阅读框(ORF)全长942 bp,编码313个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个中央蛋白激酶结构域。推导的Lmirak4氨基酸序列与其他鱼类Irak4氨基酸序列具有高度一致性。组织分布结果显示,lmirak4在各组织中表达具有差异性,在头肾中表达量最高。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)与哈维弧菌(Vibrio harveyi)后,花鲈头肾、肝脏和脾脏中lmirak4 mRNA的表达水平显著增加。亚细胞定位显示,外源性Lmirak4主要分布于HEK-293T细胞质中,在花鲈头肾原代培养细胞中成功表达但无明显分布差异。     

黄姑鱼转录因子激活蛋白AP2α的克隆和特征分析

转录因子激活蛋白AP2α是一类能特异地结合DNA的核转录因子，参与动物胚胎发育的调节、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生以及免疫反应等多种生物过程。课题组前期通过基因组关联分析(GWAS)发现，AP2α是黄姑鱼(Nibea albiflora)抗哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的候选基因。本研究克隆了黄姑鱼转录因子AP2α，其开放阅读框(ORF)为1 275 bp，编码424个氨基酸；所编码的AP2α蛋白质N端是富含脯氨酸和谷氨酰胺(P/Q-rich domain)的反式激活结构域，中间是中心基本结构(central basic region)，C端为高度保守的helix-span-helix基序，负责结合DNA和蛋白质二聚化。氨基酸序列多重比对表明，AP2α保守性强，与所检测的鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物同源性在84.63%以上。实时荧光定量PCR检测结果显示，AP2α基因的mRNA广泛分布于所检测的黄姑鱼9 种组织样品中，其中血液中的表达量最高；受哈维氏弧菌攻毒感染后，肝脏、脾脏和头肾中AP2α表达量均明显升高，特别是在肝脏中，AP2α mRNA表达水平在24 h时达到攻毒前的39倍。通过构建重组真核表达质粒pGEFP-AP2α并转染HEK293T细胞进行亚细胞定位研究的结果显示，AP2α分布于HEK293T细胞的细胞核中。进一步通过原核克隆表达获得了可溶性的GST-AP2α融合蛋白。以上结果表明，AP2α在黄姑鱼抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。本研究对AP2α在硬骨鱼类先天免疫中的重要功能提供了新的见解，为深入研究黄姑鱼的分子免疫机理和抗病分子育种奠定了基础。     

饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响

为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析

从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组数据中筛选出泛素核糖体融合蛋白Ub S27基因(ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein,Pm Ub S27)片段,利用SMART-RACE技术克隆出Pm Ub S27基因c DNA全长,并利用软件对其结构进行分析;利用实时荧光定量技术检测Pm Ub S27基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果显示,Pm Ub S27基因c DNA全长为514 bp,开放阅读框465 bp,编码154个氨基酸,含有泛素(1~72 aa)和核糖体蛋白(101~147 aa)2个结构域。以DNA为模板克隆得到的基因序列由3个内含子和4个外显子组成。实时荧光定量结果显示,Pm Ub S27基因在斑节对虾各组织中均有表达,但是在卵巢中表达量最高,其次为肝胰腺、血淋巴和精巢。Pm Ub S27在卵巢发育前期(Ⅱ期)和成熟期(Ⅴ期)的表达量显著高于其他各期(P0.05)。结果表明,Pm Ub S27参与斑节对虾卵巢发育的过程并可能在卵巢发育进程中起到重要的调控作用。     

半滑舌鳎蛋白激酶C-alpha(PKCα)的基因克隆和免疫应答分析

蛋白激酶C(PKC)广泛参与哺乳动物T、B淋巴细胞涉及的免疫反应并发挥重要作用，然而PKC在鱼类免疫过程中的作用却少有报道。本研究在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了PKC家族的典型成员PKCα(命名为CsPKCα)，并进行了分子特征和表达模式分析。CsPKCα的cDNA全长为2315 bp，其中，开放阅读框(ORF)为2013 bp。qRT-PCR分析显示，CsPKCα在各个组织中广泛表达，其中，在鳃、肝脏、皮肤和肠中具有较高的转录水平，表明CsPKCα可能在免疫过程中发挥作用。随后检测了CsPKCα在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后6种免疫相关组织(鳃、肝脏、皮肤、肠、脾脏和肾)中不同时间点的表达水平，发现细菌侵染后24 h或48 h，CsPKCα在鳃、肾脏、皮肤和脾脏中显著上调，侵染后12 h在肝中有显著性下调。研究表明，CsPKCα可能在应对哈维氏弧菌的免疫应答中发挥作用，但是否参与病原菌侵染的巨噬细胞激活以及与T、B细胞相关的信号通路还需要进一步研究。这是关于PKCα参与鱼类细菌性免疫反应的首次报道。     

东北七鳃鳗NF-κB基因启动子的构建及活性

核转录因子NF-kB(Nuclear factor kappa B)对机体的免疫反应、炎症反应等起重要的调控作用。为了获得NF-kB基因启动子的活性报告基因，进一步研究原始脊椎动物免疫应答的机制，我们根据此前克隆得到的东北七鳃鳗(Lethenteron morii)NF-kB基因cds序列，以与东北七鳃鳗高度同源的日本七鳃鳗(Lampetra japonica)同源基因 5’上游启动子特征序列为模板设计引物，克隆获得了东北七鳃鳗NF-kB启动子序列，该序列全长3169 bp，提交至NCBI Genbank获得登录号MN368861。经AliBaba2.1软件预测该序列包含CREB (cgtgacttca)、Oct-1 (aatatgaatt)、GATA-1 (gaacctatct)、AP-1 (ggttgagtca)、NF-kappa B (ctttcctgtt)、IRF-1 (tttcctgttc)、Sp-1 (tgtgaggggt)、c-Jun (acgtgacttc)和c-Fos (ggttgagtca)等多个转录因子结合位点，并包含TATA box转录核心元件。通过MethPrimer软件预测在序列1207-1402 bp处存在CG含量大于50%，长196 bp的CpG岛。利用双酶切技术构建了pGL3-NF-kB-pro重组质粒，并将其转染至人胚肾细胞系（Human embryonal kidney, HEK293T）和鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）中。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示该片段序列在哺乳动物细胞系和鱼类细胞系中均具有启动子活性，同时在HEK293T中经过Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）的配体LPS刺激后启动子活性显著上升。本研究成功构建了东北七鳃鳗NF-kB启动子报告基因，并在不同细胞系中证实了其活性。LPS刺激后的检测结果揭示东北七鳃鳗NF-kB参与了TLR信号通路的免疫应答。东北七鳃鳗NF-kB报告基因的构建为探究原始脊椎动物免疫系统信号传导机制奠定了基础。     

尼罗罗非鱼β-actin基因启动子的分离及其在真核细胞中的活性验证

采用高保真PCR方法从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因组DNA中分离出β-actin基因启动子序列,将β-actin基因启动子插入pN1-EGFP构建成真核细胞表达载体pEGFP-β-actin,并通过脂质体转染法将重组载体导入人胚肾上皮细胞HEK 293T,荧光显微镜下观察外源基因EGFP...     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

发酵豆粕替代鱼粉对凡纳滨对虾生长、免疫相关酶及免疫相关基因表达的影响

从免疫相关酶活及基因转录水平角度探讨发酵豆粕替代鱼粉对凡纳滨对虾健康生长及免疫机能机制的影响。实验设置5种实用饲料,以30%鱼粉组(FM)为对照组,分别用4%(FSM4)、8%(FSM8)、12%(FSM12)和16%(FSM16)的发酵豆粕,替代9.7%、19.4%、29.1%和38.8%鱼粉,分为4个处理组,饲养体质量为(7.62±0.23)g的凡纳滨对虾60 d后,统计生长性能,检测肌肉营养成分、血清及肝胰腺免疫相关酶活性,肝胰腺HSP70和鳃Toll受体、IMD、溶菌酶(LZM)免疫相关基因m RNA的表达水平。结果显示:(1)与对照组相比,发酵豆粕替代鱼粉对凡纳滨对虾成活率无显著影响;过低或过高水平的发酵豆粕替代鱼粉皆会影响凡纳滨对虾的特定生长率。(2)除FSM12组外,肌肉粗蛋白含量发酵豆粕替代组均低于对照组;粗脂肪含量随着发酵豆粕替代量的升高而降低,FSM16组最低。(3)血清谷丙转氨酶活FSM4和FSM16组显著高于对照组;谷草转氨酶活FSM4组最高,而FSM8组最低;除FSM12组外;碱性磷酸酶活性发酵豆粕替代组显著高于对照组;除FSM16组外,血清总蛋白与肝胰腺丙二醛含量发酵豆粕替代组与对照组无显著性差异。(4)随着发酵豆粕替代量增加,鳃Toll受体m RNA表达呈上升趋势,鳃IMD m RNA表达则呈先升后降趋势,发酵豆粕替代比例过高会降低鳃LZM m RNA表达水平,而肝胰腺HSP70 m RNA表达量则随着发酵豆粕替代比例增加呈上升趋势。综上所述,发酵豆粕适量替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能无显著影响,并可提高免疫相关酶活,改变免疫相关基因的表达。本实验条件下适宜发酵豆粕用量为8%~12%;替代量过高,会引起机体的过度应激。     

卵形鲳鲹TLR13基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种古老的先天性免疫受体,参与病原体相关分子模式识别,对维持免疫稳态和预防感染至关重要。本研究克隆和鉴定了卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) TLR13基因(命名为ToTLR13),其开放阅读框(ORF)为1 269 bp,编码422个氨基酸,等电点为8.13。保守结构域分析显示,ToTLR13含有跨膜结构域(TM)、LRR结构域和TIR结构域,符合TLR家族的典型特征。通过建立TLR13保守域三级结构发现,ToTLR13与小鼠(Mus musculus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13功能结构域的蛋白三级结构具有较高重叠性。多序列比对显示,ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13具有较高的相似性,与其他纲物种的序列相似性较低。系统进化树结果显示,ToTLR13与硬骨鱼TLR13聚在一起,其中与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近,与哺乳动物、两栖类和贝类相分离。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)分析显示,ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉中普遍表达,其中鳃的表达量最高,其次是脾。ToTLR13在其鳃、脾、肝和肾免疫相关组织中的表达情况呈现出不同程度的上调,提示其经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)免疫刺激后可能激活了炎症反应,启动了先天性免疫反应。亚细胞定位显示,ToTLR13定位于A549细胞质。本研究表明,ToTLR13在抵御病原菌免疫应答过程中可能发挥重要的作用,研究结果可为阐明脊椎动物TLRs的功能进化史提供基础资料。     

斑点叉尾 ipu-miR-143靶基因EB1的鉴定

采用生物信息学方法对斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)ipu-miR-143的靶基因进行预测, 并对预测到的ipu-miR-143靶基因进行生物学鉴定。生物信息学预测结果显示, 斑点叉尾 微管相关蛋白基因RP/EB家族EB1基因的3′-UTR区具有ipu-miR-143的潜在作用位点。结合对几种近缘物种中RP/EB家族EB1基因和miR-143的进化保守性进行分析, 推测ipu-miR-143在斑点叉尾 中可以通过靶向EB1基因的3′-UTR区而发挥其调控功能。因此, 本研究将斑点叉尾 EB1基因的3′-UTR区(含有miR-143靶位点)构建到pMIR-REPORTTM Luciferase载体的下游, 通过双荧光素酶报告基因检测系统对ipu-miR-143的靶基因进行鉴定。采用HEK293和CCK两种细胞进行细胞转染, 两种细胞中转染miR-143 mimics组荧光相对活性与对照组相比均表现为显著性降低(P<0.05)。共转染miR-143 inhibitors后, CCK细胞中荧光素酶相对活性(8.27±1.02)与对照组相比(5.44±1.55)显著上调(P<0.05); HEK293细胞中荧光素酶相对活性(6.30±1.19)与对照组(4.26±0.84)相比有所上升, 但无显著性差异(P>0.05)。初步研究结果提示, miR-143可以通过靶向EB1基因的3′-UTR区而发挥其调控功能。本研究旨为后续深入研究斑点叉尾 EB1基因的转录后调控机制提供基础依据。

     

In vivo screening of zebrafish microRNA responses to bacterial infection and their possible roles in regulating immune response genes after lipopolysaccharide stimulation

Micro (mi)RNAs are abundant small noncoding RNAs found in plants and animals, the regulatory functions of which are not fully understood in fish. To identify potential miRNAs, we screened an miRNA microarray with total RNA from zebrafish infected with Vibrio harveyi and another from uninfected zebrafish. Six miRNAs were obtained from the microarray screening. We studied miRNA expression patterns of 2 miRNAs (miR-122 and miR-194) after bacterial infection of transgenic zebrafish (containing tilapia hepcidin (TH)2-3) and non-transgenic zebrafish from which the 2 miRNAs were obtained from the microarray experiment. The results indicated that miR-122 and miR-194 were higher in PBS-injected zebrafish compared with TH2-3 zebrafish or wild-type (WT) zebrafish after V. harveyi infection. Overexpression of miRNAs (miR-122, miR-192, and miR-194a) was seen in zebrafish liver (ZFL) cells after lipopolysaccharide (LPS) treatment and in untreated fish. Our results showed that after 24?h of doxycycline treatment without LPS stimulation, interleukin (IL)-22, lysozyme, toll-like receptor (TLR)1, TLR3, TLR4a, and tumor necrosis factor (TNF)-α gene expressions were, respectively, upregulated by ~14-, 22-, 2.2-, 13-, 200-, and 38-fold in miR-122-transfected compared with non-transfected (WT) ZFL cells. In cells transfected with miR-192 and treated with LPS after 8-12?h, IL-22, lysozyme, TLR1, TLR3, TLR4a, and TNF-α expressions significantly differed between WT and miR-192-overexpressing ZFL cells. However, we observed significantly higher IL-22 expression levels after 12?h of LPS treatment in miR-192-transfected ZFL cells compared with non-transfected cells. In contrast, IL-22, lysozyme, and TNF-α were markedly upregulated (>100-fold) after miR-194a transfection and overexpression in ZFL cells and treatment with LPS. Our cloning and expression analyses indicated that miR-122, miR-192, and miR-194a play important roles in zebrafish immunology.     

海洋贝类Toll样受体及信号通路的研究进展

Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是模式识别受体家族(PRR)中重要的一员,它可以特异地识别病原体相关的分子模式(PAMP),激活信号级联、诱发固有免疫反应,在抵御病原微生物过程中发挥重要作用。TLRs最早在果蝇胚胎中发现,是一类进化高度保守的免疫受体家族,在果蝇及脊椎动物中研究得较为透彻。海洋贝类具有较高的经济价值及重要系统进化地位,近年来,大量贝类的Toll样受体及信号通路相关因子被发现。本文综述了Toll样受体的结构、信号通路和海洋贝类TLR及信号通路相关因子的研究进展,有助于丰富海洋贝类固有免疫理论研究。