斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

细胞分裂周期蛋白42(CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷(GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42(Pm CDC42)基因c DNA全长。生物信息学分析结果表明Pm CDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5'非编码区(UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了Pm CDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同p H、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌(Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,Pm CDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在p H和Cd胁迫下Pm CDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下Pm CDC42表达量上调,低盐胁迫下Pm CDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明Pm CDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。     

仿刺参β-胸腺素基因的克隆和表达分析

β-胸腺素是一种具有抗菌活性的多肽。采用RACE方法克隆仿刺参β-胸腺素(β-Thymosin),命名为Ajβ-Thymosin。Ajβ-Thymosin基因的序列全长1877 bp,开放阅读框为126 bp,编码41个氨基酸;分子质量为4.6 ku,理论等电点为5.25。仿刺参β-胸腺素中存在着保守的功能序列EVASFD-KSKLK和保守的G-actin结合结构域LKKTET。系统发育进化分析结果显示,仿刺参β-胸腺素和紫色球海胆的β-胸腺素聚为一支。采用实时荧光定量PCR检测Ajβ-Thymosin基因在仿刺参不同组织和不同发育时期的表达量,发现其在体腔细胞中的表达量最高,在小耳幼虫期开始高表达。经过假交替单胞菌、灿烂弧菌、蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌4种病原菌刺激后,仿刺参体腔细胞中Ajβ-Thymosin基因的表达量在4 h均受到抑制;在蜡样芽孢杆菌和希瓦氏菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在12 h开始上调;在假交替单胞菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在24 h开始上调;在灿烂弧菌组,Ajβ-Thymosin基因的表达量在48 h才开始上调。病原刺激产生的动态表达...     

斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析

以斑节对虾(Penaeus monodon)为研究对象,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾Pm GRP94基因c DNA全长,并对其结构进行生物信息学分析。Pm GRP94全长2 990 bp,包括75 bp的5'UTR、527 bp的3'UTR和2 388bp的ORF。利用实时定量PCR技术,对Pm GRP94组织特异性及其在不同p H、盐度和3种重金属应激下转录水平变化情况及特点进行了研究。结果显示,Pm GRP94基因存在组织特异性,并在肝胰腺中的表达量最高;不同的应激条件下其表达具有明显差异,其中在p H、铜(Cu)和锌(Zn)的应激下Pm GRP94的表达显著升高。因此预测该基因可以作为斑节对虾受p H、Cu和Zn胁迫的指示基因。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5’非编码区(UTR)为89 bp,3’UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。     

凡纳滨对虾黏着斑激酶基因克隆与合并感染条件下的免疫应答

采用RACE技术克隆凡纳滨对虾黏着斑激酶基因,利用相关软件工具拼接、比对其序列,构建进化树,同时利用荧光定量技术分析了该基因的组织分布和合并感染下的免疫应答。试验结果显示,凡纳滨对虾黏着斑激酶基因cDNA序列全长4919bp,ORF片段长3036bp,编码1012个氨基酸。凡纳滨对虾黏着斑激酶基因具有蛋白激酶特征结构域PTK和C端的对虾黏着结构域。荧光定量结果表明,凡纳滨对虾黏着斑激酶基因表达无组织特异性,眼部表达量最高,肌肉中表达量最低,可以被副溶血弧菌与白斑综合症病毒以及二者的合并感染诱导表达,表达量先升再降,整个试验过程中合并感染组斑激酶表达量总是高于白斑综合症病毒单独感染组。酶活测定结果表明,合并感染组酸性磷酸酶活力变化最活跃;试验后期,弧菌单独感染组碱性磷酸酶活力始终高于合并感染组,合并感染组过氧化物酶活力总是高于白斑综合症病毒单独感染组;整个试验过程中,弧菌单独感染组超氧化物歧化酶活力始终高于其他两个感染组。     

一株兼具氨氮去除能力和对副溶血弧菌拮抗作用的有益菌的筛选及其初步应用

采用无机氮筛选培养基,从对虾养殖水体和对虾肠道中分离到3株具有脱氮效果的异养硝化菌株(编号分别为20131023A00、20131023A01和20131023A05),它们在氨氮含量为0.12％的液体筛选培养基上(pH=7.2),28℃经24 h对氨氮的转化能力分别为(38.9±0.1)％、(43.1±0.4)％和(49.9±0.5)％;采用纸片法拮抗实验选出菌株20131023A05对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有拮抗作用,在1.57×105 CFU/cm2、1.57× 104 CFU/cm2和1.57× 103 CFU/cm2的副溶血弧菌平板上产生的抑菌圈直径分别为(9.14±0.05) mm、(11.57±0.03)mm和(13.59±0.02) mm.经16S rDNA序列测定,表明该菌株与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)有最近的亲缘关系.在日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)养殖水体中加入该株菌至2.5×105 CFU/ml时,该菌株表现出对副溶血弧菌注射感染的保护作用,该菌株浸浴组的日本囊对虾相对存活率(RPS)为35％.在凡纳滨对虾养殖水体中每3d加入该株细菌(3.13×104 CFU/ml),每天加入70％饲料量的赤砂糖,经60 d养殖,水体中氨氮含量比对照组及其他组显著降低.菌株20131023A05兼具去除氨氮和对副溶血弧菌拮抗作用,在对虾养殖生产中有广阔的应用前景.     

合浦珠母贝胸腺素β4(thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究

胸腺素β4(thymosinβ4)具有抗菌、抑制炎症和促进伤口愈合等作用。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)胸腺素β4(Pfthymosinβ4)的基因序列。该基因长261 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)126 bp,编码42个氨基酸。生物信息学分析发现,胸腺素β4的蛋白理论分子量为4.78 ku;具有典型的"THY"特征模体和胸腺素β家族的特征序列;氨基酸序列保守性很高,与其他物种相似性达90%以上。荧光定量PCR结果表明,Pfthymosinβ4在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高,其次是足与鳃。插核手术后取血细胞和伤口组织,Pfthymosinβ4在血细胞和伤口组织的表达量显著升高,第6小时达到最高,推测表达量升高的原因是Pfthymosinβ4促进血细胞向伤口处移动来参与合浦珠母贝伤口的前期修复。在各个发育时期中Pfthymosinβ4均有表达,在变态期的表达量突然升高,推测其可能参与了合浦珠母贝的变态附着过程。     

脊尾白虾Strawberry Notch1基因的克隆及免疫功能

为探究strawberry Notch1基因(SBNO1)在甲壳动物中的免疫功能,本文对脊尾白虾SBNO1的cDNA序列全长、系统进化、组织分布以及副溶血弧菌感染后SBNO1和Notch信号通路中相关基因表征进行了研究。结果显示,脊尾白虾SBNO1 cDNA序列全长4353 bp,共编码1380个氨基酸,预测相对分子量158.91 kDa,理论等电点4.81。qPCR分析显示,脊尾白虾SBNO1在各组织中均有表达,其中在肝胰腺里表达量最高,性腺次之。利用RNAi干扰SBNO1显示,脊尾白虾在感染副溶血弧菌后,干扰组死亡率显著高于未干扰组。副溶血弧菌感染脊尾白虾后显著影响了Notch信号通路中SBNO1、Numb与Delta在肝胰腺中的转录情况,而Jagged表达差异不显著。SBNO1和Numb的表达量随时间变化都呈现出先上升后下降的趋势,Delta的表达量呈现出先下降后上升的趋势。结果表明,Notch信号通路参与了脊尾白虾副溶血弧菌感染后的免疫。本研究有助于阐明无脊椎动物先天免疫的机制,为抗病脊尾白虾的分子育种提供理论依据。     

利用噬菌体防治对虾弧菌病的研究

用副溶血弧菌人工感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),以口服和直接浸泡副溶血弧菌噬菌体两种方式处理对虾,9天内,实验组对虾的死亡率较弧菌对照组低66.7%,实验组对虾的组织器官中和实验水体中的弧菌含量均远低于弧菌对照组.实验结果表明:口服和直接浸泡副溶血弧菌噬菌体方式均可有效防治对虾弧菌病.     

斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选

凋亡抑制因子1 (tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾(Penaeus monodon)应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激时的表达调控情况,该研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式,以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示,PmTRIAP1cDNA全长2 522 bp,包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF),共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高;哈氏弧菌刺激下,PmTRIAP1表达量显著降低,而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高,表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系;双荧光素酶报告实验结果显示,Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性,表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。     

杂色鲍AP-1的克隆及在发育和弧菌感染后的表达分析

激活蛋白1(AP-1)是具有亮氨酸拉链功能域的转录因子,参与了发育和免疫等多个生物学过程。为研究该基因在杂色鲍发育和免疫中的作用,本研究克隆了杂色鲍AP-1基因的全长cDNA(命名为HdAP-1),并分析了HdAP-1在各组织、各发育时期以及副溶血弧菌刺激后的表达特征。结果表明,HdAP-1cDNA全长为1482bp,5′非编码区域(5′UTR)为133bp,3′UTR为401bp,开放阅读框为948bp。该基因编码蛋白预测分子量为34.83ku,等电点为9.43,具有典型AP-1蛋白家族的Jun转录因子功能域和bZIP功能域。HdAP-1在所检测7个组织中均有表达,其中血淋巴表达量最高,鳃、肾、肠和黏液腺的表达量次之,肝胰腺和外套膜表达量最低。自受精卵至囊胚期HdAP-1的表达量显著低于原肠胚(P0.05),由原肠胚到担轮幼虫该基因表达量继续上升,担轮幼虫至匍匐幼虫期均维持较高的表达水平,变态后在稚鲍中的表达量下降。在副溶血弧菌感染24h后,HdAP-1表达量显著上升(P0.05)。其他时段该基因的表达量与对照组相比差异不显著(P0.05)。     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析

从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组数据中筛选出泛素核糖体融合蛋白Ub S27基因(ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein,Pm Ub S27)片段,利用SMART-RACE技术克隆出Pm Ub S27基因c DNA全长,并利用软件对其结构进行分析;利用实时荧光定量技术检测Pm Ub S27基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果显示,Pm Ub S27基因c DNA全长为514 bp,开放阅读框465 bp,编码154个氨基酸,含有泛素(1~72 aa)和核糖体蛋白(101~147 aa)2个结构域。以DNA为模板克隆得到的基因序列由3个内含子和4个外显子组成。实时荧光定量结果显示,Pm Ub S27基因在斑节对虾各组织中均有表达,但是在卵巢中表达量最高,其次为肝胰腺、血淋巴和精巢。Pm Ub S27在卵巢发育前期(Ⅱ期)和成熟期(Ⅴ期)的表达量显著高于其他各期(P0.05)。结果表明,Pm Ub S27参与斑节对虾卵巢发育的过程并可能在卵巢发育进程中起到重要的调控作用。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

中国对虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用3’和5’RACE技术从中国对虾Fenneropenaeus chinensis肝胰腺中克隆了1个血蓝蛋白基因FCHc,FCHc基因cDNA全长为2161bp。其中,开放阅读2 034bp,编码678个氨基酸,预测分子量为77.59 kDa。FCHc序列与凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血蓝蛋白同源性为82%,与日本囊虾Marsupenaeus japonicas同源性为85%。Real-timePCR实验结果表明,FCHc在肝胰腺中的相对表达量最高,在心脏和表皮中几乎不表达。该基因在鳗弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国对虾FCHc基因在免疫反应中具有重要作用。     

饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗感染和5种免疫基因表达的影响

为研究饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力和非特异性免疫基因表达水平的影响,以初体质量为(6.95±1.20)g的凡纳滨对虾为研究对象,在室内养殖箱进行3周的养殖实验和2周的副溶血弧菌人工感染实验;其中,对照组每日投喂普通商品饲料,实验组每日投喂在普通商品饲料中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌(1:1)配制成的3组实验饲料,实验饲料中益生菌的终浓度为10⁷ cfu/g。并采用实时荧光定量RT-PCR方法,对保护率最高的地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌实验组进行凡纳滨对虾相关免疫基因表达水平的分析。实验结果表明,在饲料中添加单一益生菌或复合益生菌均可显著提高对虾抗副溶血弧菌感染的能力(P<0.05),且复合益生菌的保护效果更佳,其相对免疫保护率为31.11%。感染副溶血弧菌后,地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾血淋巴中的先天免疫缺陷基因(innate immune deficiency gene,IMD)、对虾素3a分子(penaiedin 3a)、酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)和甲壳素Crustin的mRNA的相对表达量均显著上调,且分别在18～24 h达到最大值。实验结果提示:饲料中添加芽孢杆菌可有效提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力,这种能力的提高可能是通过增加抗病相关基因的表达量实现的。     

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）基因的克隆鉴定及表达分析

细胞色素氧化酶(Cytoehrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质.细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COX Ⅰ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一.本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587 bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(点:pinephelusawoara)细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因.研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1 659 bp,5'端非编码区3 bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1 551 bp,编码516个氨基酸.序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9%.采用半定量RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达.注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(P＜0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化.