斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体,在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(Pm Toll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型,通过免疫印迹方法证实Pm Toll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处Pm Toll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。q RT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路,促进通路下游髓样分化因子(My D88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达,同时酶联免疫吸附测定结果证明Pm Toll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活Pm Toll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制Pm Toll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过Pm Toll9激活Toll信号通路,引起机体免疫防御反应,而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。     

对虾Toll受体及其在虾类营养免疫评价中的应用

Toll受体是一类跨膜蛋白,其胞外区能够识别仅表达在病原微生物上的高度保守的结构基序(motifs)——病原相关的分子模式(pathogen-associated　molecular　patterns,PAMPs),并将病原入侵的信号传递到细胞内,诱导产生一系列的免疫效应因子和免疫反应。Toll受体是机体对入侵病原微生物产生免疫效应的关键分子。多种对虾中存在Toll受体,但对虾Toll受体在虾类营养免疫研究中的应用尚未得到发掘。本文综述了Toll信号途径及对虾Toll受体的研究进展,并探讨了Toll受体在虾类营养免疫评价中的应用价值,认为对虾Toll受体表达量的变化可以反映机体对入侵病原识别的灵敏性,在今后的营养免疫学研究中具有重要价值,并提出了今后对虾Toll受体研究的方向。     

花鲈irak4基因cDNA的克隆与表达分析

Toll样受体家族信号通路参与了机体特异性免疫和先天性免疫过程,白介素1受体相关激酶4 (IRAK4)是Toll样受体家族信号通路中的重要成员之一。该研究克隆了花鲈(Lateolabrax maculatus) lmirak4序列,并分析了其序列特征、表达模式及亚细胞定位。Lmirak4基因cDNA开放阅读框(ORF)全长942 bp,编码313个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个中央蛋白激酶结构域。推导的Lmirak4氨基酸序列与其他鱼类Irak4氨基酸序列具有高度一致性。组织分布结果显示,lmirak4在各组织中表达具有差异性,在头肾中表达量最高。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)与哈维弧菌(Vibrio harveyi)后,花鲈头肾、肝脏和脾脏中lmirak4 mRNA的表达水平显著增加。亚细胞定位显示,外源性Lmirak4主要分布于HEK-293T细胞质中,在花鲈头肾原代培养细胞中成功表达但无明显分布差异。     

赤点石斑鱼Toll样受体 (TLRs)基因家族的鉴定、进化与表达

为研究赤点石斑鱼Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）的进化、分布及表达模式，本研究基于已公开的赤点石斑鱼基因组和转录组数据，利用blast、系统进化与共线性等生物信息学方法，分析赤点石斑鱼TLRs基因家族的系统进化、染色体分布及在各组织中的表达模式。结果显示，在赤点石斑鱼中共鉴定出17个TLR基因，这些基因分为5个亚家族（TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR11），分别分布在24条染色体中的11条染色体上；17个TLR基因在赤点石斑鱼不同组织中具有不同的表达模式，然而，位于相同染色体上的TLR基因的不同拷贝则存在相似的表达模式。其中EaTLR18-1与EaTLR18-2均位于9号染色体上，二者的表达模式高度相似，均在心脏中高表达；同位于20号染色体上的EaTLR2-1a与EaTLR2-1b的表达模式也高度相似，均在脑中高表达；EaTLR5M与EaTLR5S同位于14号染色体上，二者不仅具有高度相似的LRR结构域，且在不同组织中的表达水平也高度相似；而位于18号染色体的EaTLR7与EaTLR8和位于4号染色体的EaTLR2-2与EaTLR3，其表达模式却存在明显差异。研究结果可为鱼类Toll样受体系统进化分析提供参考数据，也为进一步研究赤点石斑鱼Toll样受体基因的功能奠定基础。     

乌鳢诺卡氏菌病致病菌的分离、鉴定及组织病理学观察

为研究乌鳢诺卡氏菌的致病机理,本实验通过病原分离鉴定、组织病理学和基因表达水平分析对病原菌的致病性、药物敏感性及乌鳢的免疫抗性进行了研究。结果显示,患病乌鳢主要感染了命名为SDAT 0011病原菌,通过菌落形态观察、革兰氏染色鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA鉴定及诺卡氏菌特异序列扩增鉴定,结果均显示该病原菌为诺卡氏菌。将分离的SDAT 0011感染健康乌鳢后,1×105～1×108 CFU/mL注射组的死亡率均为100%,感染乌鳢出现明显的诺卡氏菌病症状,如内脏出血,肝脏、脾脏和肾脏中有大量大小不等的结节,组织病理切片进一步检测发现,结节分界清晰,结节中有大量的淋巴细胞、受损或死亡的组织细胞。药物敏感性实验发现,诺卡氏菌对利福平等抗生素较为敏感,对青霉素等具有较强的抗性。基因表达分析显示,在感染初期(48 h)及中后期,Toll样受体2基因(TLR2)和Toll样受体13基因(TLR13)在脾脏和头肾的表达水平显著上调,而趋化因子受体9基因(CCR9)在脾脏和头肾中显著下调,这表明乌鳢Toll样受体和趋化因子受体信号通路可能在其抵抗诺卡氏菌感染中起重要作用。本实验为乌鳢诺卡氏菌病的...     

转录组测序筛选克氏原螯虾卵巢发育、免疫和生长相关基因

为发掘克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长的重要功能基因,采用Illumina HiSeq~(TM) 2 500高通量测序平台对克氏原螯虾的卵巢、肝胰腺和肌肉组织进行了转录组测序。所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、pfam、COG、GO和KEGG数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。结果显示,测序共获得了53 006个unigene,平均长度为1 194 bp。对3个组织样品的测序文库进行两两比较,发现在卵巢vs.肝胰腺中有差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)20 382个,在肝胰腺vs.肌肉中有DEG 12 753个,在肌肉vs.卵巢中有DEG 21 629个。GO功能分类分析发现,部分DEG被注释到繁殖(reproduction)、繁殖过程(reproduction process)、免疫系统过程(immune system process)和生长(growth)GO条目。KEGG pathway分析显示,一部分DEG在卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的信号通路中得到了富集。根据GO功能分类和KEGG信号通路分析筛选出了大量与克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的候选基因,如卵黄蛋白原、卵黄蛋白原受体、Toll样受体2、Toll样受体相互作用蛋白、肌肉生长抑制素和5-羟色胺受体等。本研究结果丰富了克氏原螯虾的基因资源,可为克氏原螯虾的遗传育种和免疫研究提供基础数据。     

卵形鲳鲹TLR13基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种古老的先天性免疫受体,参与病原体相关分子模式识别,对维持免疫稳态和预防感染至关重要。本研究克隆和鉴定了卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) TLR13基因(命名为ToTLR13),其开放阅读框(ORF)为1 269 bp,编码422个氨基酸,等电点为8.13。保守结构域分析显示,ToTLR13含有跨膜结构域(TM)、LRR结构域和TIR结构域,符合TLR家族的典型特征。通过建立TLR13保守域三级结构发现,ToTLR13与小鼠(Mus musculus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13功能结构域的蛋白三级结构具有较高重叠性。多序列比对显示,ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13具有较高的相似性,与其他纲物种的序列相似性较低。系统进化树结果显示,ToTLR13与硬骨鱼TLR13聚在一起,其中与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近,与哺乳动物、两栖类和贝类相分离。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)分析显示,ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉中普遍表达,其中鳃的表达量最高,其次是脾。ToTLR13在其鳃、脾、肝和肾免疫相关组织中的表达情况呈现出不同程度的上调,提示其经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)免疫刺激后可能激活了炎症反应,启动了先天性免疫反应。亚细胞定位显示,ToTLR13定位于A549细胞质。本研究表明,ToTLR13在抵御病原菌免疫应答过程中可能发挥重要的作用,研究结果可为阐明脊椎动物TLRs的功能进化史提供基础资料。     

鱼类microRNA在先天免疫中的研究进展

先天免疫是宿主识别病原及消除病原感染的第一道防线。模式识别受体是参与识别病原入侵的主要分子，主要包括Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体和C型凝集素受体等。模式识别受体在识别病原相关分子模式后，激活机体的先天免疫信号通路，诱导炎症细胞因子和干扰素的产生，从而启动抵抗病原入侵的免疫应答。越来越多的证据表明，免疫应答的激活、维持和终止受到了严格的调节，使机体在保持一定免疫强度的同时避免产生过度的免疫反应。microRNA是一类长度为18～23 nt的微小非编码RNA，是鱼类先天免疫应答网络中的重要调控因子。近年来，microRNA在鱼类免疫学领域已开展了大量的研究，但缺乏对其进行及时地全面性的总结。本文综述了近年来miRNA在鱼类先天免疫反应中的研究进展，以期为鱼类的分子抗病育种及疾病防控研究提供一些思路。     

大弹涂鱼TLR基因分子进化研究及其在鳗弧菌胁迫后的表达分析

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种生活在潮间带的淤泥滩和红树林等两栖环境中的鱼类,其免疫系统面临比水生生活更大的选择压力。Toll样受体基因(简称TLR)是重要的先天免疫成员,一直是鱼类分子免疫学的研究热点之一。为了探究大弹涂鱼TLR基因是否因为其独特的生活环境而产生适应性进化以及其TLR基因在受到细菌攻击后的免疫应答模式,本研究从大弹涂鱼皮肤转录组中获得了TLR5, TLR8和TLR9完整序列以及TLR3和TLR7部分序列,采用分子生物信息学对大弹涂鱼TLR5, TLR8和TLR9基因序列以及氨基酸序列进行了分析,并根据所构建的系统发育树对5个TLR基因进行了分子进化分析,采用荧光定量PCR方法对大弹涂鱼5个TLR基因的组织表达分布和鳗弧菌攻击后5个TLR基因的免疫应答模式开展了研究。结果显示, TLR5基因全长3071 bp,包括长度为2646 bp的编码区,共编码882个氨基酸;TLR8基因全长3175 bp,包括长度为3033 bp的编码区,共编码1011个氨基酸;TLR9基因全长3398 bp,编码区长度为3093 bp,共编码1031个氨基酸。大弹涂鱼3个TLR基因与其他物种的TLR基因结构相似,具有高度保守性。位点模型结果表明,鱼类TLR3, TLR5和TLR8是高度保守的,而TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化;而进化枝-位点模型结果表明,为了适应更加复杂多变的两栖环境,大弹涂鱼TLR9基因可能产生了适应性进化。大弹涂鱼5个TLR基因在8个健康组织(肠,眼,肾,肝,脑,肌肉,脾和皮肤)中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达量较高。在受到鳗弧菌(Vibrio anguillarum)攻击后的免疫表达模式表明了大弹涂鱼5个TLR基因在应对细菌入侵时起到了重要作用。     

叶尔羌高原鳅鳃组织TLRs基因家族成员鉴定及生物信息学分析

为探究叶尔羌高原鳅(Triplophysa yearkandensis)免疫系统中TLRs基因家族的多样性、进化关系和功能特征,基于该物种鳃组织的高通量二代转录组测序数据进行了生物信息学分析,在对该物种TLRs基因家族进行鉴定的基础上分析了其系统发育和蛋白功能。结果表明,叶尔羌高原鳅鳃组织中存在11个TLRs基因家族成员,分别为TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、TLR13、TLR18、TLR22和TLR25,其中TLR7、TLR9和TLR13缺失5′端序列,而其余序列均完整。TLRs基因家族成员系统发育分析发现,可以将11个基因分为5个亚家族。蛋白功能分析发现,各个TLR基因都含有富含亮氨酸重复结构域以及TIR结构域。物种间系统发育分析显示,叶尔羌高原鳅与西藏高原鳅(Triplophysa tibetana)和玫瑰高原鳅(Triplophysa rosa)在TLRs基因家族成员方面分别聚为一类,说明3个物种亲缘关系相近。研究结果有助于深入了解叶尔羌高原鳅TLRs基因家族的进化关系和免疫功能,同时也为该物种的遗传资源保护和养殖利用提供理论基础。     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

鱼类嗅觉受体基因研究进展

嗅觉是鱼类感知外界环境的重要器官,参与觅食、定位、避敌以及生殖洄游等行为。嗅觉功能基于嗅觉信号通路并由嗅觉受体蛋白识别外界环境中的气味分子而实现。嗅觉受体基因编码G蛋白偶联受体蛋白,在脊椎动物中已发现的嗅觉受体基因有5个家族,即主嗅觉受体基因(MOR)、犁鼻器Ⅰ型受体基因(V1R/ORA)、犁鼻器Ⅱ型受体基因(V2R/OlfC)、痕量胺相关受体基因(TAAR)和甲酰基肽受体基因(FPR)。鱼类占脊椎动物所有种类的50%以上,近年有关鱼类嗅觉受体基因的研究越来越多,新的发现不断涌现,但目前国内的相关文献甚少。本文总结了鱼类嗅觉受体基因家族的研究进展,整理了研究中遇到的有关问题和相应对策,并对研究前景作了展望,旨在为国内鱼类嗅觉受体基因的研究提供参考资料。     

中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal)的重组表达及活性分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal, GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。     

低盐驯化对低盐胁迫下大黄鱼转录组的影响

为探讨低盐驯化对低盐胁迫下大黄鱼氧化损伤和转录组的影响,本实验将体重为(52.46±1.47) g的大黄鱼暴露在盐度为25或20的水体中7 d,再暴露在盐度为10的水体中24 h。结果显示,低盐胁迫显著增加了活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)含量。尽管低盐驯化对ROS和LPO不产生影响,但低盐驯化显著降低了低盐胁迫下大黄鱼ROS和LPO含量,表明低盐驯化缓解了低盐胁迫对大黄鱼的氧化损伤。从低盐驯化vs.对照组、低盐胁迫vs.对照组和低盐驯化+低盐胁迫vs.低盐胁迫实验中,分别筛选到356、478和484个差异基因。GO和KEGG分析发现,差异基因显著富集在GnRH信号通路、PPAR信号通路、凋亡、Toll样受体通路和MAPK信号通路等,表明低盐驯化可以通过调节离子和物质运输、脂类代谢、细胞凋亡和非特异性免疫等来提高大黄鱼的低盐胁迫耐受性。研究表明,低盐驯化可以通过调节离子和物质运输、脂类代谢、细胞凋亡和非特异性免疫等来提高大黄鱼的低盐胁迫耐受性。研究结果揭示了低盐驯化改善大黄鱼低盐胁迫耐受性的分子机制,可为今后工厂化和内陆采用淡水或半咸水养殖大黄鱼提供科学依据。     

鲍高温胁迫响应机制的研究进展

鲍是重要的海水养殖经济贝类之一。近年来,受夏季高温胁迫,养殖鲍时常发生大规模死亡,给养殖业者带来了巨大的经济损失。本文回顾了近年来发生的养殖鲍大规模死亡事件,并从鲍的生长、繁育、存活、代谢和酶的活性等生理生化指标,细胞免疫、抗氧化系统、热休克蛋白、调控细胞凋亡、NF-κB信号通路、PI3K-AKT信号通路等相关基因的表达,及DNA甲基化和遗传多样性等方面总结了鲍高温胁迫响应机制的研究进展。现有研究表明,高温胁迫会引起鲍的摄食、新陈代谢等生理生化的异常,破坏其机体内环境的稳态,降低其抵抗病原入侵的能力和应对外部环境刺激的能力,从而对其生长、免疫等产生不良的影响,最终降低其生长速率、繁殖效率,甚至导致鲍的死亡。在此基础上,本文提出了鲍养殖生产中高温胁迫的预防调控措施,以期为了解鲍对高温胁迫的响应机制、开展鲍的耐高温品种选育研究、预防鲍夏季高温大规模死亡的发生等提供参考。     

海洋环境中有机胺的迁移转化研究进展

大气中的有机胺具有潜在的气候效应,这是当今国际的研究热点之一。海洋是大气中有机胺的重要来源,但由于海水中有机胺检测难度较大,导致海洋环境中有机胺的产生机制尚不清楚。本文概述了海洋生物体内有机胺前体物的浓度特征及其对环境中有机胺的影响,阐述了沉积物、海水及大气中有机胺的浓度特征,分析了海洋大气气溶胶中有机胺的形成途径,并指出海水中有机胺检测的难点及现阶段亟待解决的科学问题。为深入认识海洋环境中有机胺的迁移转化规律及其潜在气候效应提供科学依据。     

草鱼TLR9基因全长cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术,从草鱼鳃组织中克隆了Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因的cDNA全长。序列分析表明,草鱼TLR9 cDNA全长3 468 bp,编码1 058个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、16个富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat,LRR)、1个跨膜区和1个TIR结构域(Toll/IL-1 receptor)。该蛋白的分子量为121 921 u,等电点为8.80。氨基酸序列的同源性分析显示,草鱼TLR9与鲤TLR9的同源性最高(85%),依次为斑马鱼(82%)、大西洋鲑(55%)、虹鳟(55%)。在系统发生树上,草鱼TLR9首先与鲤科的鲤和斑马鱼聚类。通过半定量RT-PCR检测可知,草鱼TLR9在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达最高,其次为血、头肾等。这些结果为进一步深入研究TLR-9的功能及开发草鱼免疫增强剂奠定基础。     

仿刺参MyD88依赖途径基因的序列比较和表达分析

为探索仿刺参体内免疫调控机制,对TLR信号通路MyD88依赖途径中Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel的氨基酸序列保守结构域进行了比较分析,找到上下游基因之间可能的互作位点。采用实时荧光定量PCR的方法检测仿刺参体腔细胞中这6个基因在灿烂弧菌刺激后4个时间点的表达模式。试验结果显示,Toll在12 h表达小幅上调,在其他时间点都处于被抑制的状态;MyD88和TRAF6的表达模式基本一致,在12 h表达水平最高;IRAK4在12 h表达上调,在48 h恢复到初始状态;P105和Rel是NFκB的两个同源物,具有相似的结构域,并且这两个基因表达模式一致。通过基因序列和表达模式的对比分析发现,仿刺参体内存在一条高度保守的TLR信号通路。在应对灿烂弧菌入侵时,该通路上的6个基因协同合作参与了机体信号转导和免疫应答的过程。