海洋贝类Toll样受体及信号通路的研究进展

Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是模式识别受体家族(PRR)中重要的一员,它可以特异地识别病原体相关的分子模式(PAMP),激活信号级联、诱发固有免疫反应,在抵御病原微生物过程中发挥重要作用。TLRs最早在果蝇胚胎中发现,是一类进化高度保守的免疫受体家族,在果蝇及脊椎动物中研究得较为透彻。海洋贝类具有较高的经济价值及重要系统进化地位,近年来,大量贝类的Toll样受体及信号通路相关因子被发现。本文综述了Toll样受体的结构、信号通路和海洋贝类TLR及信号通路相关因子的研究进展,有助于丰富海洋贝类固有免疫理论研究。     

大弹涂鱼TLR基因分子进化研究及其在鳗弧菌胁迫后的表达分析

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种生活在潮间带的淤泥滩和红树林等两栖环境中的鱼类,其免疫系统面临比水生生活更大的选择压力。Toll样受体基因(简称TLR)是重要的先天免疫成员,一直是鱼类分子免疫学的研究热点之一。为了探究大弹涂鱼TLR基因是否因为其独特的生活环境而产生适应性进化以及其TLR基因在受到细菌攻击后的免疫应答模式,本研究从大弹涂鱼皮肤转录组中获得了TLR5, TLR8和TLR9完整序列以及TLR3和TLR7部分序列,采用分子生物信息学对大弹涂鱼TLR5, TLR8和TLR9基因序列以及氨基酸序列进行了分析,并根据所构建的系统发育树对5个TLR基因进行了分子进化分析,采用荧光定量PCR方法对大弹涂鱼5个TLR基因的组织表达分布和鳗弧菌攻击后5个TLR基因的免疫应答模式开展了研究。结果显示, TLR5基因全长3071 bp,包括长度为2646 bp的编码区,共编码882个氨基酸;TLR8基因全长3175 bp,包括长度为3033 bp的编码区,共编码1011个氨基酸;TLR9基因全长3398 bp,编码区长度为3093 bp,共编码1031个氨基酸。大弹涂鱼3个TLR基因与其他物种的TLR基因结构相似,具有高度保守性。位点模型结果表明,鱼类TLR3, TLR5和TLR8是高度保守的,而TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化;而进化枝-位点模型结果表明,为了适应更加复杂多变的两栖环境,大弹涂鱼TLR9基因可能产生了适应性进化。大弹涂鱼5个TLR基因在8个健康组织(肠,眼,肾,肝,脑,肌肉,脾和皮肤)中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达量较高。在受到鳗弧菌(Vibrio anguillarum)攻击后的免疫表达模式表明了大弹涂鱼5个TLR基因在应对细菌入侵时起到了重要作用。     

半滑舌鳎TLR5S 三种剪切型基因的克隆与表达分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。     

叶尔羌高原鳅鳃组织TLRs基因家族成员鉴定及生物信息学分析

为探究叶尔羌高原鳅(Triplophysa yearkandensis)免疫系统中TLRs基因家族的多样性、进化关系和功能特征,基于该物种鳃组织的高通量二代转录组测序数据进行了生物信息学分析,在对该物种TLRs基因家族进行鉴定的基础上分析了其系统发育和蛋白功能。结果表明,叶尔羌高原鳅鳃组织中存在11个TLRs基因家族成员,分别为TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、TLR13、TLR18、TLR22和TLR25,其中TLR7、TLR9和TLR13缺失5′端序列,而其余序列均完整。TLRs基因家族成员系统发育分析发现,可以将11个基因分为5个亚家族。蛋白功能分析发现,各个TLR基因都含有富含亮氨酸重复结构域以及TIR结构域。物种间系统发育分析显示,叶尔羌高原鳅与西藏高原鳅(Triplophysa tibetana)和玫瑰高原鳅(Triplophysa rosa)在TLRs基因家族成员方面分别聚为一类,说明3个物种亲缘关系相近。研究结果有助于深入了解叶尔羌高原鳅TLRs基因家族的进化关系和免疫功能,同时也为该物种的遗传资源保护和养殖利用提供理论基础。     

缢蛏Toll样受体家族基因全基因组水平鉴定及其在弧菌刺激下的表达分析

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国传统的四大海水养殖贝类之一,养殖过程中易受病原菌感染而造成大量死亡和经济损失。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是目前研究最多的模式识别受体,在无脊椎动物的先天性免疫中发挥着重要作用。研究缢蛏TLR分子特征及其免疫功能对预防和控制病原菌感染至关重要。本研究从缢蛏基因组序列中鉴定出42个TLR基因(ScTLR),其中,33个编码典型的TLR蛋白,其他9个为TLR样蛋白。根据蛋白结构域特点,将典型的TLR蛋白分为2大类4个亚类,一类为多半胱氨酸簇TLR (mccTLR),包括1个P型TLR和7个sPP型TLR;另一类为单半胱氨酸簇TLR (sccTLR),包括16个sP型TLR和9个Ls型TLR。与其他9种软体动物TLR基因的类型和数目比较结果显示,缢蛏基因组中未发现其他软体动物中存在的V型和Twin-TIR型TLR,起源古老的mccTLR类群在软体动物中没有大规模的扩张,而起源较晚的sccTLR类群却发生了大规模的扩张。荧光定量PCR分析显示,6种ScTLR在检测的7种组织中普遍表达,且在血细胞、鳃和肝胰腺组织中高表达。最后,副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)胁迫12 h和48 h的缢蛏鳃和肝胰腺转录组数据分析显示,副溶血弧菌感染前后9个TLR基因在鳃或肝胰腺中的表达量发生显著变化,6个基因(ctg118.25、ctg118.26、ctg356.25、ctg774.6、ctg681.6和ctg1513.5)在感染12 h或48 h后的鳃组织中表达差异显著,前5个基因表达量上调,仅ctg1513.5表达量下调;3个基因(ctg467.9、ctg2496.3和ctg903.17)在感染12 h或48 h后的肝胰腺中表达差异显著,其中,ctg467.9和ctg2496.3表达量下调,ctg903.17表达量上调。综上所述,本研究结果将为深入探讨不同TLR基因在缢蛏天然免疫中发挥的作用提供研究基础。     

仿刺参MyD88依赖途径基因的序列比较和表达分析

为探索仿刺参体内免疫调控机制,对TLR信号通路MyD88依赖途径中Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel的氨基酸序列保守结构域进行了比较分析,找到上下游基因之间可能的互作位点。采用实时荧光定量PCR的方法检测仿刺参体腔细胞中这6个基因在灿烂弧菌刺激后4个时间点的表达模式。试验结果显示,Toll在12 h表达小幅上调,在其他时间点都处于被抑制的状态;MyD88和TRAF6的表达模式基本一致,在12 h表达水平最高;IRAK4在12 h表达上调,在48 h恢复到初始状态;P105和Rel是NFκB的两个同源物,具有相似的结构域,并且这两个基因表达模式一致。通过基因序列和表达模式的对比分析发现,仿刺参体内存在一条高度保守的TLR信号通路。在应对灿烂弧菌入侵时,该通路上的6个基因协同合作参与了机体信号转导和免疫应答的过程。     

卵形鲳鲹TLR13基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种古老的先天性免疫受体,参与病原体相关分子模式识别,对维持免疫稳态和预防感染至关重要。本研究克隆和鉴定了卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) TLR13基因(命名为ToTLR13),其开放阅读框(ORF)为1 269 bp,编码422个氨基酸,等电点为8.13。保守结构域分析显示,ToTLR13含有跨膜结构域(TM)、LRR结构域和TIR结构域,符合TLR家族的典型特征。通过建立TLR13保守域三级结构发现,ToTLR13与小鼠(Mus musculus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13功能结构域的蛋白三级结构具有较高重叠性。多序列比对显示,ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13具有较高的相似性,与其他纲物种的序列相似性较低。系统进化树结果显示,ToTLR13与硬骨鱼TLR13聚在一起,其中与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近,与哺乳动物、两栖类和贝类相分离。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)分析显示,ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉中普遍表达,其中鳃的表达量最高,其次是脾。ToTLR13在其鳃、脾、肝和肾免疫相关组织中的表达情况呈现出不同程度的上调,提示其经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)免疫刺激后可能激活了炎症反应,启动了先天性免疫反应。亚细胞定位显示,ToTLR13定位于A549细胞质。本研究表明,ToTLR13在抵御病原菌免疫应答过程中可能发挥重要的作用,研究结果可为阐明脊椎动物TLRs的功能进化史提供基础资料。     

乌鳢诺卡氏菌病致病菌的分离、鉴定及组织病理学观察

为研究乌鳢诺卡氏菌的致病机理,本实验通过病原分离鉴定、组织病理学和基因表达水平分析对病原菌的致病性、药物敏感性及乌鳢的免疫抗性进行了研究。结果显示,患病乌鳢主要感染了命名为SDAT 0011病原菌,通过菌落形态观察、革兰氏染色鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA鉴定及诺卡氏菌特异序列扩增鉴定,结果均显示该病原菌为诺卡氏菌。将分离的SDAT 0011感染健康乌鳢后,1×105～1×108 CFU/mL注射组的死亡率均为100%,感染乌鳢出现明显的诺卡氏菌病症状,如内脏出血,肝脏、脾脏和肾脏中有大量大小不等的结节,组织病理切片进一步检测发现,结节分界清晰,结节中有大量的淋巴细胞、受损或死亡的组织细胞。药物敏感性实验发现,诺卡氏菌对利福平等抗生素较为敏感,对青霉素等具有较强的抗性。基因表达分析显示,在感染初期(48 h)及中后期,Toll样受体2基因(TLR2)和Toll样受体13基因(TLR13)在脾脏和头肾的表达水平显著上调,而趋化因子受体9基因(CCR9)在脾脏和头肾中显著下调,这表明乌鳢Toll样受体和趋化因子受体信号通路可能在其抵抗诺卡氏菌感染中起重要作用。本实验为乌鳢诺卡氏菌病的...     

盐度对赤点石斑鱼受精卵发育的影响及仔鱼活力的判断

观察比较了10个盐度梯度（44.0,41.0,38.0,35.0，自然海水盐度30.5-32.5,27.0,24.0,21.0,18.0,15.0)下赤点石斑鱼受精卵的孵化率和畸形率，对12批初孵仔鱼进行耐饥饿试验。并测定其不投饵存活系数SAI值。结果表明，赤点石斑鱼受精卵孵化的适宜盐度为38.0-24.0，最适盐度为35.0-27.0。盐度高于35.0，孵化率随盐度的升高而降低，仔鱼畸形率则随之升高。盐度低于24.0，孵化率随盐度的降低而降低，仔鱼畸形率则随之升高，从盐度38.0到41.0以及24.0到21.0是2个对受精卵孵化率和仔鱼畸形率影响很大的盐度梯度，高于或低于这2个盐度梯度，孵化率即明显大幅度降低，畸形率则大幅度升高，赤点石斑鱼仔鱼的SAI值为3.19-12.42，低于长吻Sheng和黄条Shi的SAI值，仔鱼的SAI值与卵的受精率，孵化率呈正相关关系。只有SAI值大于5的仔鱼才有可能被进一步培育成苗，低于5的将在数天内死亡。     

β-1,3-葡聚糖对副溶血弧菌感染菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的存活及两种免疫基因表达影响

本文以菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)为材料,开展了不同浓度β-1,3-葡聚糖对正常菲律宾蛤仔及副溶血弧菌(Viβrio parahaemolyticus)感染后蛤仔的存活率和凝集素基因(Lectin)、Toll样受体2基因(TLR2)的表达研究。结果显示,β-葡聚糖浸泡蛤仔可以有效提高副溶血弧菌感染后蛤仔的存活率,在1000 mg/L浓度下,存活率最高,未感染组的鳃组织中,TLR2在6 h时达到峰值,显著高于其他时间(P0.05)。在感染组中,TLR2呈先升高后降低的趋势,在1.5 h时达到峰值。感染组和未感染组的Lectin表达均为先升高后下降趋势。在3 h时,100 mg/L未感染组的Lectin相对表达量显著高于100 mg/L感染组(P0.05)。在外套膜中,感染组和未感染组TLR2在3~12 h之间表达量逐渐降低。在24 h时,1000 mg/L未感染组表达量最高。感染组Lectin在外套膜中,浓度为1000 mg/L的实验组比100 mg/L实验组各时段都有更高的表达量,但只有0和24 h时差异显著(P0.05)。蛤仔鳃和外套膜Lectin的表达模式不同,但β-葡聚糖的浸泡都促进了Lectin在感染初期的表达。从结果上看,β-葡聚糖的浸泡会增加这2种基因的相对表达,被β-葡聚糖浸泡过的蛤仔被副溶血弧菌感染后,会更为快速地表达TLR2和Lectin。本研究旨在通过不同浸泡浓度β-葡聚糖对蛤仔存活及免疫基因表达的影响,初步了解β-葡聚糖对蛤仔免疫力的作用,为蛤仔亲贝的保种、苗种繁育及池塘养殖的疾病防控提供一定的理论依据。     

斑点叉尾鮰TLR20和TLR21基因在不同细菌和病毒 感染后的表达特征

应用实时荧光定量PCR技术,检测了TLR20和TLR21基因在斑点叉尾鲴Ictalurus punctatus感染迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和斑点又尾鲴呼肠孤病毒（Channel Catfish Hemorrhage Reovirus,CCRV）后,在0、12、24、48、72h、7d,肝脏、头肾、脾脏、肠中的时空表达特征。结果显示,4种病原均能引起斑点叉尾鲴TLR20、TLR21基因在所测免疫相关组织中表达量的变化,但呈现出不同的表达模式：感染嗜水气单胞菌后这两种基因的表达差异巨大,而TLR21基因的表达变化不大,在肝脏和头肾中表达量仅在3倍以内变化。感染爱德华氏茵后,TLR20、TLR21两种基因的表达模式类似,在肝脏中表达量显著上调。链球菌引起肝脏TLR20表达量发生4360倍的变化,远远高于TLR21基因在同组织中的表达量（257．8倍）。斑点叉尾鲴呼肠孤病毒感染引起TLR20、TLR21两种基因在肝脏、头肾的上调表达,肠、脾脏的下调表达。以上结果表明了TLR20、TLR21在斑点叉尾鲴天然免疫应答中起重要作用,为研究鱼类疾病防御机制提供了理论参考。     

斑点叉尾TLR5和TLR5S基因在不同病原诱导下的表达特征

分别用迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、链球菌Streptococcus iniae和斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒(channel catfish hemorrhage reovirus,CCRV)对斑点叉尾(鱼回)Ictalurus punctatus进行感染实验,取感染后0h、12h、24h、48h、72h和7d的头肾、肠、肝脏和脾脏,采用实时定量PCR方法检测了TLR5和TLR5S基因在这4种免疫相关组织中的时空表达特征,探讨它们与斑点叉尾(鱼回)先天免疫反应的关系.结果表明,链球菌和迟钝爱德华氏菌能够引起TLR5和TLR5S强烈的上调表达,其中以感染链球菌12h后TLR5S在头肾中的表达上调量最为显著,与对照组相比提高了132倍(P＜0.01).在感染嗜水气单胞菌后的24h内TLR5和TLR5S基因的表达量上升,但随后却显示出了明显的下调趋势,而斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒在TLR5和TLR5S基因表达中起到了明显的抑制作用,于大部分组织中表达下调.在感染12h的脾脏中,TLR5基因的表达量仅为对照组的0.017倍(P＜0.01),而TLR5S基因表达量达到最低,仅为对照组的0.01倍(P＜0.01).从不同的组织来看,TLR5在肠中的表达上调幅度最大,而TLR5S在头肾中的表达增幅最明显,如感染链球菌和迟钝爱德华氏菌12h后,TLR5在肠中的表达量分别增加了50.4倍(P＜0.01)和14.8倍(P＜0.01),TLR5S在头肾中的表达量分别上升了52.8倍(P＜0.01)和132倍(P＜0.01).以上结果进一步证明了TLR5和TLR5S基因在斑点叉尾(鱼回)先天免疫反应过程中发挥着非常重要的作用,同时在抗病原侵袭过程中表现出了一定的组织特异性和病原特异性.     

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。     

Molecular cloning of sea perch (Lateolabrax japonicus) TLR1 and analysis of its expression pattern after stimulation with various bacteria

Toll‐like receptors (TLRs) play an indispensable role in fish immunity, being involved in pathogen recognition and the triggering of immune reactions. Here, a member of the TLR family, TLR1, from Lateolabrax japonicus was characterized and its expression pattern and intracellular localization were analysed. The full‐length LjTLR1 cDNA (2,755 bp) was found to encode a polypeptide of 827 amino acids. The deduced amino acid sequence contained three main structural domains: an extracellular leucine‐rich repeat domain, a transmembrane domain and a Toll/IL‐1 receptor domain. Tissue distribution analysis indicated that LjTLR1 was expressed in all of the examined tissues to varying degrees, with the highest levels being measured in the head kidney. In order to assess the antibacterial functions of LjTLR1 during infection, the pathogenic bacteria Vibrio harveyi and Streptococcus agalactiae were used. LjTLR1 was significantly upregulated in the three immune organs (the head kidney, spleen and liver) following bacterial stimulation, and its expression was detected 6 hr after initial exposure. In mRNA in situ hybridization experiments, positive signals were more numerous in the treatment group than the control group, verifying the expression patterns observed. Assessment of the intracellular localization of LjTLR1 revealed it to be present in the cytoplasm. These results indicate the potential role of LjTLR1 in immune responses to bacterial infection. This study enriches our knowledge of L. japonicus immune genes and provides a theoretical basis for further research concerning the antibacterial functions of fish TLRs during infection.     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。