长牡蛎糖原磷酸化酶基因SNPs与生长性状和糖原含量的相关性分析

为研究糖原磷酸化酶基因多态性与长牡蛎(Crassostrea gigas)生长和糖原含量的相关性,本研究对长牡蛎糖原磷酸化酶基因(Cg-GPH)编码区单核苷酸多态性(SNPs)与来自5个家系322个长牡蛎个体的生长性状(包括壳高、壳长、壳宽、总体质量以及软体部质量)和糖原含量进行了关联分析.结果表明,在1940 bp的长牡蛎糖原磷酸化酶基因中共检测到82个SNPs位点,其中63个SNPs位点位于外显子区域,1个SNPs位点位于5′-UTR区,18个SNPs位点位于3′-UTR区,编码区SNPs平均密度为1/25 bp;5个SNPs位点与生长性状存在显著相关(P<0.05),未检测到与糖原含量相关SNPs.根据以上5个SNPs位点共构建得到6个SNP单倍型,其中,Cg-GPH基因的H6(CTGAT)单倍型在总体质量性状方面均显著高于其他5种单倍型(P<0.05),表明H6单倍型可能是对长牡蛎体质量增加最有利的单倍型.研究结果为今后长牡蛎生长性状的遗传改良提供了基础资料.     

三角帆蚌HcTyr基因内壳色性状相关SNP筛选及图谱定位

为研究三角帆蚌HcTyr基因与内壳色性状的相关性,本实验根据已分离的三角帆蚌HcTyr基因进行引物设计和片段扩增,并用144只三角帆蚌对其多态性进行筛选和验证,卡方检验分析了SNP位点和三角帆蚌内壳色相关性,并对HcTyr基因进行了图谱定位。结果显示,在HcTyr基因上筛选出8个SNP位点,其中有7个SNP位点与三角帆蚌内壳色L、a及d E呈显著相关性,用这7个SNP位点做单倍型构建和分析,发现Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ这3种单倍型在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,而Ⅴ和Ⅶ这2两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。进一步在商业养殖群体中验证发现,Ⅳ和Ⅶ这2种单倍型可分别作为白色和紫色群体的优势单倍型。研究表明,三角帆蚌HcTyr基因可作为内壳色相关的候选基因,其部分SNP位点可用于三角帆蚌分子辅助育种。另外本实验还将HcTyr基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

长牡蛎MITF基因表达及与壳色的关联

为了解长牡蛎MITF基因的表达及其与壳色的关联,验证了长牡蛎中的4个MITF基因,对长牡蛎MITF氨基酸序列进行了序列分析和多序列比对,分析了长牡蛎幼体发育各时期的转录组,采用荧光定量PCR的方法研究长牡蛎各组织及黑壳、白壳牡蛎特定部位mRNA表达情况。4个MITF基因中有3个基因可能为假基因,有表达的长牡蛎MITF基因共编码448个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,含有N端结构域(MITFTFEBC3N superfamily)和高度保守的功能性结构域HLH结构域。转录组分析发现MITF在长牡蛎个体发育的各个时期均有表达,在稚贝期达到最高。组织表达结果显示MITF在外套膜中的表达水平显著高于其他组织。MITF在黑壳牡蛎闭壳肌中的表达量显著低于白壳牡蛎,而在黑壳牡蛎外套膜中的表达量高于白壳牡蛎,但不显著。在黑壳、白壳牡蛎外套膜边缘的表达量都显著高于内侧。研究表明,长牡蛎MITF基因可能在牡蛎壳形成早期就参与了黑色素的生成调控和个体的生长发育,可调控牡蛎酪氨酸酶Tyr2基因,参与外套膜和贝壳中黑色素的形成。本研究为进一步研究牡蛎壳色形成机制奠定了基础。     

长牡蛎壳橙性状遗传参数评估及与生长性状的关联性

长牡蛎壳橙快速生长品系是结合群体选育与种内群体间杂交方法，以壳色性状和生长性状为选育指标，经过连续3代选育获得的新品系。本研究以第1代长牡蛎壳橙快速生长品系(G₁)为亲本，采用巢式设计建立了48个混养家系，共获得863个个体。利用微卫星标记对混养家系进行了系谱分析，并基于REML法评估了长牡蛎壳橙快速生长品系壳色性状的遗传参数及与生长性状的相关性。结果显示，863个个体中，有851个个体被准确鉴定其所属家系；长牡蛎壳橙快速生长品系壳色性状颜色参数指标a^*(红绿轴色品指数)、b^*(黄蓝轴色品指数)和ΔE (色差)等均具中高等遗传力，大小依次为0.47±0.23、0.42±0.21和0.56±0.29。4个颜色参数指标间的遗传相关和表型相关范围分别为-0.79~0.86和-0.45~0.48。壳色性状与各生长性状的遗传相关和表型相关较低，分别为-0.33~0.17和-0.04~0.11。研究表明，在长牡蛎壳橙快速生长品系育种过程中，对壳色性状进行选育可以得到预期的改良效果。此外，壳橙性状与生长性状应分别作为目标性状进行协同选择，以实现同时改良两个性状的目的。本研究可为长牡蛎壳橙快速生长品系选育提供基础资料。     

长牡蛎壳金选育群体生长性状的选择效应

长牡蛎是一种世界性的养殖贝类,同时是我国最重要的经济贝类之一,壳色美观和快速生长是目前长牡蛎遗传育种的2个重要目标。2010年通过长牡蛎壳色性状的家系选育,获得了壳白、壳黑、壳金和壳紫4种壳色品系。实验以第二代壳金品系为基础群体,对长牡蛎壳金群体的生长性状进行定向选育,分析了长牡蛎壳金选育群体壳高性状的选择反应、遗传获得和现实遗传力。结果显示,养成阶段选择组的壳高均大于对照组,350日龄后表现出显著的生长优势;幼虫期,壳高性状的平均选择反应、遗传获得和现实遗传力分别为0.549±0.277、3.717%±2.611%和0.339±0.171,养成期分别为0.436±0.138、8.253%±1.014%和0.270±0.086。选择组的贝壳金黄色和外套膜金黄色比例分别提高了22%和10%。研究结果为长牡蛎壳金优良品系培育提供了重要基础资料。     

文蛤SRBI基因变异与红壳色性状的关联性

为了解文蛤体内类胡萝卜素代谢相关基因清道夫受体B类I(Mm-SRBI)与红壳色形成的关联性,采用直接测序法对基因编码区进行SNP筛查和关联分析,并用免疫荧光、蛋白免疫印迹分析了Mm-SRBI蛋白在红、白壳色文蛤外套膜中的表达差异。结果显示,在Mm-SRBI基因的编码区筛选到15个SNP位点,位于保守序列上的4个突变位点c.647C/T、 c.723A/G、 c.818C/T、 c.1037A/G与红、白壳色存在显著关联,其中c.723A/G位点为非同义突变(异亮氨酸突变为缬氨酸),且4个位点在遗传上存在强连锁性;蛋白免疫印迹与免疫荧光结果表明,Mm-SRBI在红壳中的蛋白表达量显著高于白壳文蛤,主要表达部位为外套膜边缘膜的纤毛处。研究表明,Mm-SRBI基因的高表达与变异可能导致文蛤对类胡萝卜素的代谢产生差异,从而在生长发育过程中导致红壳色的形成。     

草鱼GH基因3''部分序列多态性与生长性状及肌肉成分的相关性分析

为了解草鱼GH基因多态性与早期生长性状及肌肉成分的相关性,实验利用直接测序法从156尾草鱼GH基因的3′部分序列中共筛选到9个变异位点(分别命名为SNP1~SNP9:G2825A、G2914T、T2966G、A3002T、T3022C、A3301G、C3463T、C3547T、C3620T)。卡方检验结果显示,9个位点均未显著偏离Hardy-Weinberg平衡,且均表现为中等多态性(0.25PIC0.5);经连锁不平衡分析发现,SNP3、SNP4和SNP5位点为一组完美连锁不平衡,SNP2、SNP7、SNP9位点为一组完美连锁不平衡;GH基因3′部分序列5个位点单倍型分析共发现6种单倍型,其中Hap1(30.4%)所占的比例最高,Hap6(4.8%)所占比例最低。利用GLM及多重比较对草鱼GH基因中9个SNPs多态性与早期生长性状和肌肉成分进行相关性分析,发现SNP2和SNP3位点的纯合突变型在体质量、体长和粗脂肪性状上均显著高于野生型和杂合突变型;在双倍型分析时得出了相似的结果,同时含有SNP2和SNP3位点纯合突变的双倍型组合在生长和粗脂肪性状上均显著性高于其他组合。研究表明,草鱼GH基因中SNP2和SNP3位点与早期生长性状及肌肉成分存在显著性相关,可作为草鱼生长及肉质改良的候选辅助分子标记,并且为进一步对相关变异位点的功能验证奠定研究基础。     

鳜pep和gh基因SNP标记与驯食性状的关联分析

以鳜(Siniperca chuatsi)选育群体为实验材料,在易驯食与不易驯食鳜转录组Unigene数据库中共预测到4809个SNP位点,其中胃蛋白酶基因(pepsinoge, pep)和生长激素基因(growth hormone, gh)均为转录组筛选获得的鳜驯食性状候选基因,本研究将候选基因上的多态SNP位点在易驯食和不易驯食鳜群体中进行基因分型,并与鳜驯食性状进行关联分析。在易驯食与不易驯食的鳜群体中共发现5个单核苷酸(SNP)多态性位点,有效等位基因(N_e)在1.1959～1.7001,观测杂合度(H_o)和期望杂合度(H_e)分别分布于0.1800～0.3585和0.1655～0.4160,多态信息含量(PIC)为0.2477,全部位点都属于中度多态性位点。结果表明SNP位点pep-A T/C中2种基因型TT和CT与鳜驯食性状呈高水平显著相关(P0.05),组合得到的3种基因型Genotype1(CT,CC/CT/TT,AA,AA,TT)、Genotype2(TT,CC/CT/TT, AA, AA, TT)和Genotype3(TT, CC, AA, AA, TT)也与鳜驯食性状呈高水平显著相关(P0.05),显著影响鳜驯食性状表型,其中Genotype2相关性最高,可作为最优基因型个体进行选育。本研究在鳜pep和gh基因中鉴定出与驯食性状呈显著关联的SNP分子标记,为加快易驯食鳜新品种的基因辅助选育提供有效的SNP分子标记。     

三角帆蚌HcTyp-1基因珍珠层颜色性状相关SNP筛选及图谱定位

本实验室根据前期研究发现,HcTyp-1基因可能参与了三角帆蚌贝壳珍珠层颜色的形成。本实验根据HcTyp-1基因cDNA设计引物,比较筛选获得了8个SNP位点并分析了这些位点与内壳色的相关性,然后对HcTyp-1基因进行了图谱定位。通过研究这些多态性位点与贝壳珍珠层颜色性状相关性发现,C+3057T位点基因型仅在a参数上存在显著差异,G+2985T和T+3006C 2个位点基因型分别在L、b及a、dE上存在显著差异,A+2834C、C+2919T和G+2986T这3个SNPs位点基因型在L、a及dE上均存在显著差异。连锁不平衡结果显示,HcTyp-1基因上除C+2912T、C+2983A这2个位点,其他6个位点具有显著差异,位点之间都存在强连锁不平衡。单倍型分析结果显示,单倍型T2和T4在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,T6和T8两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。因此HcTyp-1基因的部分SNPs可作为三角帆蚌不同内壳色贝壳辅助育种的候选分子标记位点。另外,本研究还将HcTyp-1基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

壳白长牡蛎基因型与环境互作(G×E)效应分析

为探索壳白长牡蛎品系的壳色性状和生长性状的基因型与环境互作(G×E)效应,利用巢氏设计构建全同胞家系,每个家系分成两组分别在乳山和荣成海域进行养殖。利用线性混合模型和REML法分析11月龄壳白长牡蛎生长性状和壳色性状的遗传力及G×E效应。采用最佳线性无偏预测法(BLUP法)估计壳高和L~*两个性状的育种值,并通过加权获得综合育种值来筛选优良家系。结果显示,乳山组和荣成组的壳白长牡蛎生长和壳色性状的遗传力不同,分别为(0.14±0.08)～(0.62±0.18)和(0.01±0.03)～(0.78±0.19),可能存在尺度效应。以不同环境为固定效应,综合两个环境计算出的生长和壳色性状的遗传力为(0.02±0.02)～(0.51±0.09),然而由于部分全同胞家系缺失和模型不收敛的原因,估计模型中未包括母本/共同环境效应和显性效应,上述遗传力估计值偏高。本研究中生长和壳色性状在两个环境间的遗传相关为(–0.47±0.40)～(0.75±0.18),均小于0.8,表明壳白长牡蛎品系的生长和壳色性状都具有明显的重排效应,壳白长牡蛎品系其选育需要针对不同的养殖环境培育不同适应性的选育家系。综合育种值排名前20的个体其家系来源比例表明,家系G1和G21对于乳山海域表现出特殊的适应性,而家系G4、G22和G5对荣成海域环境具有特适性,家系G2则对两个环境具有普适性。研究为壳白长牡蛎品系的良种选育提供了重要的参考依据。     

5种壳色长牡蛎不同组织中金属元素的分析与评价

为评估不同壳色长牡蛎金属元素价值,实采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)和近红外(NIR)分析模型对5种壳色(壳黑、壳紫、壳橙、壳金和壳白)长牡蛎4个组织(外套膜、鳃、闭壳肌和性腺—内脏团)中的Mg、Fe、Zn、Cu、Mn和Se元素含量进行检测分析,并比较与对照群体金属元素含量的差异以及5种壳色长牡蛎各组织间含量的差异。结果发现,在外套膜中,壳紫、壳橙和壳黑长牡蛎中Zn含量显著高于对照群体,壳紫长牡蛎Cu含量显著高于壳金和对照群体,壳金长牡蛎Mn含量显著高于壳紫和壳黑长牡蛎,其他元素在各群体中含量无显著差异;在鳃中,壳金长牡蛎Mn含量显著高于壳黑和对照群体,其他组份在6个群体无显著性差异;在闭壳肌中,壳橙和壳紫长牡蛎Zn的含量显著高于对照群体,其他组份在各群体中差异不显著;在性腺—内脏团中,壳橙长牡蛎Zn和Mn含量均显著高于对照群体,且Cu的含量显著高于壳金长牡蛎,其他元素在6个群体中含量无显著性差异。4个组织中各金属元素含量差异显著,其中闭壳肌内各金属元素含量显著低于鳃、外套膜和性腺—内脏团。研究表明,不同壳色长牡蛎之间以及不同壳色与对照群体之间在部分金属元素含量上已表现出分化,这为长牡蛎壳色新品系选育提供了重要的基础资料。     

长牡蛎第三代选育群体生长性状的选择效应

为了培育长牡蛎的高产抗逆新品种,实验采用群体选育方法构建了中国、日本和韩国3个种群的快速生长选育系,2007年至今已连续进行了6代选育。本实验对长 牡蛎选育F₃代壳高和活体体质量的增长、选择反应和遗传获得等遗传参数进行了分析。结果表明,从第120日龄开始,中国、日本和韩国3个选育群体的壳高和 活体体质量均显著高于对照组,在420日龄时,平均壳高较对照组分别高13.4%、10.1%和10.5%,平均活体体质量较对照组分别重18.5%、13.4%和11.6%;壳高的平均现实遗传力分别为0.447±0.226、0.471±0.297和0.367±0.167,表明适于对壳高的生长速度进行进一步的选育。长牡蛎中国、日本和韩国选育F3代活体 体质量的遗传获得平均值分别为16.01%±3.82%、15.03%±5.21%和11.57%±5.15%,表明对长牡蛎壳高的生长速度进行选育时,活体体质量的生长速度也得到了明显提高。本研究结果可以为长牡蛎快速生长品系的连续选育提供依据。     

壳金长牡蛎家系的建立及生长和存活性状的比较

于2014年6月,以经过2代家系选育和2代群体选育共连续4代选育的壳金长牡蛎为亲本,采用巢式设计,成功构建25个全同胞家系,同时以未经选育的壳色即普通灰白色的个体子代为对照组,评估各家系和对照组在幼虫、稚贝期的生长和存活差异。结果显示,不同时期,壳金长牡蛎选育家系各生长性状平均值均高于对照组平均值,其中在幼虫期不同日龄,壳金长牡蛎所有家系壳高和存活率平均值均高于对照组,分别提高2.27%~16.67%和1.72%~9.40%;在稚贝期各阶段,壳金长牡蛎所有家系壳高、壳长、总重量及存活率的平均值均高于对照组,分别提高10.04%~19.79%、6.56%~17.78%、10.44%~32.92%和0.20%~4.26%;不同壳金家系间的生长及存活性状具有显著差异,排序也存在不一致性,其中G19和G28家系表现出较高的生长及存活性能,在11月龄,G19和G28家系的壳高、壳长、总重的累积生长量比所有家系平均值分别提高4.78%、8.22%、12.38%和7.61%、4.02%、9.04%,与对照组相比,分别提高15.31%、15.31%、24.11%和18.42%、10.85%、20.42%;存活率比所有家系平均值和对照组分别提高11.70%、12.71%和11.92%、12.94%。研究表明,壳金长牡蛎选育群体的生长性状具有一定的优势,但存活性状有待进一步的改良;家系G19和G28可作为优良品种培育的育种材料。本研究为培育快速生长和存活率高的壳金长牡蛎新品种提供了基础资料。     

利用微卫星荧光多重PCR技术分析壳白长牡蛎3代人工选育群体的遗传多样性

为了探讨壳白长牡蛎人工选育对群体遗传变异的影响,实验利用4个多重PCR组合共10个微卫星标记分析了连续3代壳白长牡蛎人工选育群体和野生群体及基础群体的遗传多样性。结果发现,6个群体的平均等位基因数量为7.2~12.6,等位基因丰度为6.8~11.0,期望和观测杂合度分别为0.672~0.769和0.486~0.542;与野生群体相比,3代选育群体的平均等位基因数显著降低,但平均期望杂合度并无显著差异。哈迪—温伯格平衡检验结果显示,在60个群体—位点组合中有39个群体—位点组合显著偏离哈迪—温伯格平衡,近交系数F_(is)范围为0.215~0.342。群体间遗传分化指数F_(st)范围为0.005~0.076,处于中—低等的遗传分化水平。研究表明,虽然连续选育对群体的遗传多样性和遗传分化造成了一定程度的影响,但人工选育群体依然表现为较高的遗传多样性,仍可以一定的选择压力对选育群体进行人工选育。     

长牡蛎生长性状遗传力、遗传相关和表型相关分析

为了查清乳山(RS)和崆峒岛(KTD)海域长牡蛎生长性状各指标的遗传力、遗传相关和表型相关,本实验通过部分因子交配设计和人工授精的方法建立家系,并在乳山和崆峒岛海域进行养殖。用混合线性模型分别计算RS和KTD海域188日龄、338日龄和474日龄长牡蛎生长性状各指标的遗传参数。结果发现:不同日龄长牡蛎生长性状各指标,在乳山海域的遗传力是0.28~0.55,为中高遗传力,在崆峒岛海域的遗传力是0.34~0.63,为高遗传力;与乳山海域相比,崆峒岛海域各指标的遗传力偏高。运用亲本模型,将日龄和地点作为固定效应,计算得到壳高、壳长、壳宽和湿重的遗传力分别为0.25±0.08、0.29±0.09、0.14±0.05和0.26±0.09。不同海域、不同日龄的遗传相关和表型相关结果各不相同,但各指标间均呈现正相关;总体来讲,性状间的遗传相关大于表型相关。实验结果有助于掌握山东半岛南北两侧长牡蛎生长性状的数量遗传学参数,为制定长牡蛎在该海域的选育技术路线提供数据支持。     

缢蛏EGFR基因内含子1内SNP位点多态性与生长性状相关性

为研究缢蛏表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)的相关性。本实验利用直接测序法从缢蛏EGFR基因的第一个内含子序列中共筛选到17个SNP位点。卡方检验结果显示,在17个位点中,有13个位点符合Hardy-Weinberg平衡,位点多态性检测显示17个位点中有10个位点表现为中等多态性(0.25PIC0.5)。利用一般线性模型(general linear model,GLM)及多重比较对缢蛏EGFR基因中17个SNPs的多态性与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)进行相关性分析,结果显示,16个SNP位点均与缢蛏的壳长、壳宽、壳高及体质量呈显著性相关。由此可见,EGFR基因可作为缢蛏生长性状改良的候选辅助分子标记,并且为进一步研究其生长相关功能奠定基础。     

大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联

肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸。采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变。用SNa Pshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测。结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg定律。采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现,C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

5种壳色长牡蛎不同组织常规营养成分分析与评价

对壳黑、壳紫、壳橙、壳金和壳白5种壳色长牡蛎(Crassostrea gigas)不同组织包括闭壳肌、外套膜、鳃、性腺-内脏团的营养成分(水分、总蛋白质、总脂肪、糖原、灰分)进行检测分析,比较它们与普通养殖群体营养成分的差异以及5种壳色长牡蛎各组织间营养成分的差异。结果表明,在闭壳肌中,壳紫长牡蛎的总脂肪含量显著高于壳橙长牡蛎(P0.05),其他组分在6个群体中未表现出显著性差异(P0.05);在外套膜中,壳金长牡蛎总脂肪含量显著高于壳黑、壳橙和普通养殖群体(P0.05),壳白长牡蛎的灰分含量显著高于普通养殖群体(P0.05),其他组分在各群体之间未表现出显著性差异(P0.05);在鳃中,长牡蛎壳橙、壳紫、壳白选育群体的糖原含量显著低于对照组(P0.05),其他组分在6个群体之间没有显著性差异(P0.05)。长牡蛎5种壳色选育群体和普通养殖群体的性腺-内脏团在水分、总蛋白质、总脂肪、糖原和灰分中均无显著性差异(P0.05)。4个组织中水分和灰分均以外套膜和鳃中含量最高,闭壳肌中总蛋白质的含量则在4个组织中居首位,总脂肪和糖原含量均以性腺-内脏团中最高。研究结果表明不同壳色长牡蛎之间以及不同壳色与普通对照群体之间在一些重要营养成分上已表现出分化,这为长牡蛎壳色品系选育提供了重要的参考资料。