传染性造血器官坏死病毒微型基因组表达干扰素对病毒的抑制效应

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。     

传染性造血器官坏死病毒新疆株的分离与鉴定

在新疆维吾尔自治区某养殖场取患病虹鳟Oncorhynchus mykiss组织样本,进行传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离鉴定、电镜观察、回归感染及遗传进化分析研究。细胞培养结果显示:患病虹鳟组织样本能够感染鲤Cyprinus carpio上皮细胞(carp epithelial cell,EPC)产生典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),收集病毒悬液命名为XJ-13。滴度测定实验表明:该病毒为10~(6.15)TCID_(50)/m L。回归感染实验表明:该分离株在浓度为10~5PFU/尾的剂量使体质量5g的虹鳟死亡率达87.5%。通过透射电镜观察发现患病虹鳟组织悬液感染的EPC细胞内存在大量的子弹状病毒粒子,PCR鉴定结果表明该病毒为IHNV。XJ-13的糖蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒株与我国IHNV-Sn1203株具有最高的同源性(99%),与美国参考株WRAC的同源性为94.6%。结果表明:IHNV XJ-13是造成该养殖场虹鳟大量死亡的病原。     

传染性造血器官坏死病毒-Sn株基质蛋白基因克隆及生物信息学分析

基质蛋白(matrix protein,M)是传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)主要结构蛋白之一,是病毒感染后造成细胞凋亡的主要作用蛋白。为分析IHNV M蛋白的序列及结构特征,研究利用敏感细胞(EPC)培养传染性造血器官坏死病毒-Sn分离株(IHNV-Sn),根据M蛋白基因开放阅读框(open reading frame,ORF)的序列设计引物,利用RT-PCR的方法克隆得到M蛋白全长ORF,并且构建至表达载体pET27b(+)中,构建出pET27-M重组质粒。生物信息学分析结果显示,M蛋白基因的序列长度为588 bp,编码195个氨基酸残基,推导分子量约为21.88 ku,等电点为9.35;氨基酸序列分析表明,M蛋白富含丝氨酸、苏氨酸以及碱性氨基酸,存在丰富的α-螺旋、β折叠和无规则卷曲;M蛋白不含有信号肽;疏水性大于亲水性;没有跨膜区存在;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点,存在7个潜在的O-糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析显示,IHNV-Sn株与美国分离株同为一簇。     

克氏原螯虾白斑病毒株(WSSV-Cc)基因组的一个印迹

从自然感染、濒死的克氏原螯虾中分离出的白斑病毒株(Cambarus clarkii whispovirus,WSSV-Cc或Cc株)是一株基因组较小的新毒株。为寻找白斑病毒进化过程在基因组中留下的印迹,进行了显微和超微观察、基因组架构与系统发育分析及相关基因扩增等研究。选择Cc株74L、86L、87R、88R、92R和95R的6个基因,与8个白斑病毒株的同源基因所编码蛋白序列构建进化树,结果可分为克氏原螯虾病毒(Cc株、CN02株、Pc株)和海水对虾病毒(CN株、CN01株、CN03株、CN04株、TW株和KR株) 2支。再对不同毒株的同源蛋白进行多重序列比对,显示Cc-87R是与海水对虾病毒株同源蛋白差异显著、缺失跨膜区(TMD)及其相邻287 aa序列、但仍有完整PI3K_rbd结构域的病毒膜蛋白。进一步设计和使用87R-F/87R-R和238-F/87R-R两对引物,分别以淡水小龙虾病毒Cc株和海水对虾病毒CN株的基因组为模板进行核酸扩增,结果从Cc株模板中扩增到大小为709 bp,含Cc-87R全部序列的核酸片段;而从CN株的模板中却扩增到大小分别为1 600和4 810 bp,仅含Cc-87R部分序列的核酸片段,为Cc-87R是Cc株基因组中一个序列结构独特的印迹提供了实验证据。这一发现将有助于克氏原螯虾白斑病毒病原的检测及其流行趋势预警。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。     

玻璃缺鳍鲶线粒体全基因组序列测定与分析

本文采用参照近缘物种线粒体基因组设计覆盖全基因组引物的方法构建并获得玻璃缺鳍鲶Kryptopterus vitreolus线粒体基因组全序列,分析其全序列特征和结构,为鲇形目鱼类的系统进化研究提供基础数据。结果表明,玻璃缺鳍鲶线粒体基因组全长16 662bp,碱基组成具有高AT含量的偏向性,结构组成和排列顺序和其他硬骨鱼基本一致,包括13个蛋白质编码基因、22个t RNA、2个r RNA和1个D-loop区。全基因组中除COX1以GTG为起始密码子外,其余12个编码蛋白的基因都以ATG开头。7个编码蛋白基因(ND1、Cox1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5和ND6)以TAA终止,其余6个编码蛋白的基因没有完整的终止密码子。对玻璃缺鳍鲶线粒体基因组D-loop区的终止序列区、中央保守区和保守序列区的结构分析,识别5个保守序列(CSB-1、CSB-2、CSB-3、CSB-D和CSB-E)和一个潜在的终止序列E-TAS。利用玻璃缺鳍鲶分别与其他4种鱼的线粒体基因组全序列及13个编码蛋白基因的核苷酸序列进行比对分析。结果表明,玻璃缺鳍鲶与南方鲇Silurus meridionalis同源性最高,5种鱼线粒体基因组中COX1基因相对最保守,相似度为78.98%~92.78%。基于5个科12种鱼与2个外群物种的线粒体控制区(D-loop区)的核酸序列构建的系统进化树表明:玻璃缺鳍鲶独自一支且与鲇Silurus asotus和南方鲇亲缘关系最近。     

黄带拟鲹线粒体基因组测序及鲹科鱼类系统发育分析

摘要: 为深入开展黄带拟鲹种质鉴定、分类及遗传进化等研究,通过二代高通量测序与生物信息学分析,揭示了黄带拟鲹(Pseudocaranx dentex)线粒体基因组全序列基因结构及鲹科鱼类系统发育特征。结果显示,黄带拟鰺线粒体基因组为典型的环状DNA结构,序列全长为16 570 bp,碱基组成分别为A(27.2 %)、G(17.18%)、C(30.24%)和T(25.38%),包括13种蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因,除ND6、tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer、tRNAGlu、tRNAPro外,其余基因均在H链上编码,且基因组存在多处重叠区域。除CO Ⅰ和ND5的起始密码子分别为ATC和ATA外,其余11个蛋白编码基因的起始密码子均为ATG,以典型的TAA和TAG为终止密码子,在Cyt b中存在不完全终止密码子T;黄带拟鲹线粒体基因组全序列与蛋白编码基因的A+T含量分别为52.58%和51.55%,非编码控制区(D-loop)A+T富含61.69%,具有明显的AT偏好性。除tRNASer-(GCT)外,其余21个tRNA均含典型三叶草二级结构。为进一步研究黄带拟鲹系统进化特性,通过与18种鲹科鱼类线粒体基因组全序列及16S rRNA基因构建系统进化树显示,黄带拟鲹与高体若鲹同属一个分支,亲缘关系最近。结果可为黄带拟鲹物种鉴别、遗传多样性评价与保护提供技术依据。     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。     

对一株NDV分离毒株全基因序列的测定及分析

新城疫病毒(NDV)基因组为单股负链RNA分子,全长大约15 kb,其编码基因顺序为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'[1],6个结构基因之间由不同长度的基因间隔区别开,依次编码6种病毒蛋白,分别为核衣壳蛋白、基质蛋白、血凝素-神经氨酸酶、磷蛋白、大蛋白和融合蛋白。除此之外,还有V和W蛋白,它们与磷蛋白具有相同的N末端不同的C末端。本试验对一株新城疫最新分离毒株进行基因组长度测序,以此为依据对NDV病毒整个基因组不断演化过程进行进一步的研究探索。     

黄条鰤线粒体全基因组测序及结构特征分析

通过二代测序、软件拼接获得中国黄海海域黄条鰤(Seriola aureovittata)线粒体基因组全序列。其序列全长为16609 bp,碱基组成分别为A(26.68%)、G(17.84%)、C(30.12%)和T(25.36%);共有13条蛋白编码基因, 22个tRNA基因, 2个rRNA基因,除NAD6、trnQ、trnA、trnN、trnC、trnY、trnS、trnE、trnP外,其余基因均在H链上编码。黄条鰤线粒体基因组全序列与蛋白编码基因的A+T含量分别为52.05%和51.085%,具有明显的AT偏好性。线粒体基因中存在2个散在重复序列,分别位于NAD1基因序列正义链的中游和COX2基因序列反义链的上游。在其22个tRNA基因中,除了tRNAGly外,均具有典型的三叶草二级结构。黄条鰤线粒体基因组的蛋白编码基因起止位点与密码子除COX1、NAD5外,均与日本海域出产的黄条鰤(Seriola lalandi)完全吻合,且COX1、NAD5基因皆短于日本黄条鰤;两者间存在一定的遗传差异。基于18种隶属于13属的鲹科鱼类线粒体基因组全序列构建系统发生树,可知小甘鲹(Seriolina nigrofasciata)、黄条鰤、五条鰤(Seriola quinqueradiata)、高体鰤(Seriola dumerili)、长鳍鰤(Seriola rivoliana)同属一近支,且黄条鰤与五条鰤亲缘关系最近,与小甘鲹进化距离较远。     

编码鳜传染性脾肾坏死病毒结构蛋白新基因ORF90.5L的鉴定分析

鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidhey necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111 362 bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF).21307年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(core gene)ORF90.5L.本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963 bp的PCR产物.该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35 kD,含有预测的跨膜区,与虹彩病毒属(Iridovirus)其他成员编码的肉豆蔻基膜蛋白有较高的同源性.将该片段克隆到原核表达载体pET32a(+)中,纯化表达的重组蛋白pET90.5L免疫昆明鼠获得高效价多克隆抗体.利用抗pET90.5L抗体与纯化病毒进行免疫印迹,结果表明,抗pET90.5L的多抗可以特异性识别病毒粒子中大小约为35 kD的蛋白条带,ORF90.5L编码的蛋白应为病毒的结构蛋白.本研究旨在为ISKNV基因工程疫苗的研发和病源侵染机制研究提供基础参考.     

草鱼天然抗性相关巨噬蛋白基因全长cDNA的克隆与表达分析

天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白.本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析.该基因cDNA序列全长为3158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白.该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM).草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间.草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3味端非翻译区(UTR)和5'UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IRE).系统进化分析表明,草鱼Nramp和所有鱼类Nramp聚为一簇,与哺乳类Nramp2的亲缘关系较近.Nramp基因在单鱼头肾和脾脏中的表达量最高,在肌肉和皮肤中的表达量最低,在草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾脏细胞系(CIK)中的表达量明显升高.     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫(NewcastleDisease,ND)抗体鸡群仍然发生新城疫(ND)的情况,应用分子流行病学技术,对所分离的18株鸡源新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化,以SDS-蛋白酶K(或Trizol法)提取病毒RNA,RT-PCR扩增其融合蛋白(F)基因532bp或280bp关键片断,经回收克隆到pMD18-T载体上进行核苷酸序列测定(GenBank序列号:AY208680-AY208698)。核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83.1%～100%,氨基酸同源性为85.5%～100%;系统发育进化树分析显示,其中JL-12、HLJ-3为弱毒株,与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型;其余17株均为强毒株,其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型,其余15株均为基因Ⅶ型,由此可见东北地区目前新城疫的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所发,但以基因Ⅶ型为主,这与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

奥利亚罗非鱼DMT基因克隆与序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)睾丸DMT(DM-do-main gene in testis)基因,并进行序列测定与分析。结果表明,该基因cDNA序列全长1 260 bp,包括74 bp 5’非翻译区,879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区,阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明,不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性,显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析表明:DMT基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途中多种信号的调控。该基因的成功克隆及生物信息学分析不仅为DMRT1基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料,而且对进一步研究其编码蛋白的结构与功能以及其在鱼类性别调控中的作用具有重要意义。[中国水产科学,2007,14(1):23-31]     

急性病毒性坏死病毒魁蚶株IAP-86基因全长cDNA克隆和生物信息学分析

为深入探讨急性病毒性坏死病毒(Acute Viral Necrosis Virus, AVNV)魁蚶株的致病机理以及IAP-86蛋白的功能,从感染 AVNV 的濒死魁蚶外套膜中提取总 RNA,反转录获得 cDNA。根据 NCBI公布的 AVNV 全基因组序列中 ORF86序列设计两对反向套式引物,通过 cDNA 末端快速扩增(RACE)技术获得 ORF865￠端和3￠端的非编码区,拼接获得全长 cDNA 序列。Blast 序列比对显示,该基因与牡蛎疱疹病毒的同源性为100%,与栉孔扇贝 AVNV 的同源性为99%,并存在重叠基因。生物信息学分析预测,该蛋白不含信号肽,不存在跨膜区,最大疏水指数为1.800,最小疏水指数为–3.456。该蛋白存在8个潜在的磷酸化位点(包括5个丝氨酸、1个苏氨酸和2个酪氨酸),存在 1个潜在的 O-糖基化位点,不存在潜在的 N-糖基化位点;其抗原表位主要集中在8?11、14?16、28?39、75?76、88?95、97?100和147?158位氨基酸。推测该株病毒可能为牡蛎疱疹病毒的变异株,并且基因重叠在该类病毒进化过程中可能扮演重要角色。     

传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株ORF3基因的原核表达及生物信息学分析

为探究本实验室分离的传染性皮下及造血组织坏死病毒NJ株(IHHNV-NJ)ORF3基因编码蛋白的结构特征,本实验根据ORF3基因序列设计引物,利用PCR方法克隆ORF3基因序列,并构建至原核表达载体p ET-32a(+)中。对成功构建的p ET32a-ORF3重组表达载体进行原核表达,获得49 ku的融合蛋白,符合预期大小。通过生物信息学软件对ORF3基因编码蛋白序列进行分析,结果显示,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸;ORF3基因编码蛋白理论分子质量为37 385.2 u,等电点为7.22,为亲水性蛋白;该编码蛋白序列不存在跨膜区、信号肽切割位点;二级结构含有55.9%的α-螺旋、52.0%的β-折叠以及13.4%的β-转角;抗原表位分布较广泛,抗原性强;该编码蛋白序列不存在潜在的N-糖基化位点,存在13个潜在的O-糖基化位点和17个潜在的磷酸化位点。进化树结果表明,NJ株的ORF3基因编码蛋白序列与6株IHHNV序列同源性均高于96%,与厄瓜多尔株同源性最高,为99.7%。研究表明,ORF3基因编码IHHNV衣壳蛋白;O-糖基化位点可参与衣壳蛋白的组装过程及细胞侵染过程,磷酸化位点可参与病毒在对虾细胞内的增殖过程;ORF3编码蛋白序列保守性强,不影响病毒毒力和个体间感染能力。     

四川彭州地区养殖虹鳟传染性造血器官坏死病病毒的分离、鉴定及病理学观察

近期,四川省成都彭州市某虹鳟养殖场暴发流行疾病,导致养殖虹鳟死亡率高达90%。现场采样观察发现患病鱼主要症状为背部发黑,鳔壁、腹膜严重出血,心包积液,空肠、空胃和显著肠炎。同时对病鱼进行细菌学与组织病理学检测,细菌学检查结果为阴性,病理学观察发现脾脏有典型凝固性坏死,肝脏组织广泛变性、坏死,肠道黏膜下层水肿,肠上皮充血及上皮细胞脱落坏死,脑膜和心外膜水肿。将病鱼的脾组织研磨过滤除菌后,腹腔注射60尾健康虹鳟,注射组均表现为急性死亡(累计死亡率达85%),试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常。取病鱼的脾脏组织研磨过滤后接种胖头鲤细胞(fathead minnow cell,FHM),细胞感染3 d后出现典型的细胞病变效应(CPE)。针对编码IHNV糖蛋白(Glycoprotein,G)基因进行逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测显示,患病鱼、人工感染病鱼和病变细胞均为IHNV阳性,扩增序列与IHNV糖蛋白基因同源性为98.2%。对该病毒分离株的G基因进行系统发育分析,结果显示,该分离株与亚洲分离株聚为一簇,属于JRt基因型。     

奥利亚罗非鱼线粒体基因组全序列测定与系统进化分析

采用LA-PCR(long amplification polymerase chain reaction)扩增方法获得奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)线粒体基因组全序列.分析表明,序列全长16 632 bp,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个长度为931 bp的主非编码区.A、T、G、C碱基的组成分别为27.89％、25.50％、15.62％、30.99％.基因排列与罗非鱼属的其他物种一致.13个蛋白质基因除COX1用TGT做起始密码子外,其他均以ATG为起始,终止密码子除COX2、Cyt b、ND4为不完整的T,其余基因均以典型的TAA做终止密码子.22个tRNA的二级结构都具有典型三叶草结构.系统发育分析显示,罗非鱼属与丽鱼科(Cichlidae)其他物种分开,聚为单系群,其中奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,莫桑比克非鱼和罗非鱼KM-2006亲缘关系较近.本研究旨在为进一步利用线粒体基因组分析罗非鱼群体遗传多样性、亲缘关系以及丽鱼科系统进化提供基础依据.