鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ与Ⅲ的反应原性和免疫原性比较

为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明：含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋...     

猪cripto促进C2C12细胞分化

应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术,对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建,探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示,phiC31-cripto真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染phiC31载体和cripto基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,且对细胞的生长增殖无显著性影响;Q-PCR检测MyoD、MyoG、P21、MHC结果证实,猪cripto可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC的表达。结果表明,本试验成功地构建了C2C12-phiC31-cripto过表达细胞系,Q-PCR结果分析发现cripto基因可以促进肌肉分化,为进一步探索cripto基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据。     

猪CD151基因的克隆及过表达细胞系的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要感染猪肺泡巨噬细胞,但对猪源的其他细胞系不易感。本试验通过构建PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,为深入研究PRRSV感染宿主细胞的机制奠定基础。应用分子生物学方法、实时荧光定量PCR和荧光显微镜技术,对基因CD151在组织中的分布情况进行检测、基因克隆、真核表达载体的构建、对CD151在PK15和3D4/21细胞内的过表达情况,以及对细胞生长增殖的影响进行了研究。结果显示:CD151基因在不同组织内均有表达,但表达量有差异;PB真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染PB载体和CD151基因共转染的PK15和3D4/21细胞表达强烈的绿色荧光,实时荧光定量PCR分析结果进一步证实,CD151在转染后的细胞中获得超表达,并且对细胞的生长增殖无影响。本试验成功构建了PK15-CD151和3D4/21-CD151过表达细胞系,过表达细胞系的成功构建为进一步探索CD151在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了细胞模型,特别是对深入研究PRRSV的入侵及宿主识别具有重要意义。     

石榴皮水提物与几种抗菌药物体外联合抗菌作用观察

为评价石榴皮水提物与抗菌药物体外联合抗菌作用的效果,试验采用双层打孔法检测石榴皮水提物的抑菌能力,采用微量二倍稀释法测定石榴皮水提物的最小抑菌浓度(MIC),使用棋盘法测定石榴皮提取物与庆大霉素、阿米卡星、链霉素、多西环素和恩诺沙星联用对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用效果。结果表明：制备的石榴皮水提物具有抑菌效果;对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为1.25 mg/mL和5 mg/mL;石榴皮水提物联合阿米卡星对大肠杆菌表现为相加作用,联合链霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现为相加作用,联合庆大霉素对大肠杆菌表现为颉颃作用。说明石榴皮水提物可以与阿米卡星和链霉素联用,均表现为相加作用。     

猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建

为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA(shRNA)文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。     

豫南地区犬细小病毒流行株遗传变异分析

为了了解豫南地区犬细小病毒(canine Parvovirus, CPV)流行株的遗传变异特征，试验利用PCR方法从临床采集的CPV阳性犬的粪便中扩增CPV的VP2和NS1基因，并测定核苷酸序列，利用软件Meglign 7.0推导VP2和NS1基因的氨基酸序列并构建进化树，进行同源性和氨基酸变异分析。结果表明：从8份粪便样品中分离得到8株CPV流行株，分别命名为CH-XY-1～CH-XY-8。基于VP2基因推导的氨基酸序列，豫南地区流行株CH-XY-7和CH-XY-8为New CPV-2a亚型，CH-XY-5为New CPV-2b亚型，CH-XY-1、CH-XY-2、CH-XY-3、CH-XY-4和CH-XY-6为CPV-2c亚型，CH-XY-3和CH-XY-6分别存在1个(G299R)和2个(V84E和V153A)新的氨基酸变异。基于NS1基因推导的氨基酸序列，流行株CH-XY-5、CH-XY-6、CH-XY-7和CH-XY-8分布在GroupⅠ群，其中CH-XY-6和CH-XY-8分别存在1个新的氨基酸变异位点，分别为N356K和E583K;CH-XY-1、CH-XY-2、CH-X...     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。