3型鲤疱疹病毒白介素10单克隆抗体制备与应用

白介素（Interleukin，IL）10是 脊椎动物Th2细胞（T helper 2 cell）和先天淋巴细胞（Innate lymphoid cell）分泌的一种多效应细胞因子。3型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV3）ORF134编码IL10样蛋白，本研究构建了ORF134原核表达质粒，在大肠杆菌DE3感受态细胞中表达CyHV3-IL10重组蛋白。SDS-PAGE分析结果表明，重组CyHV3-IL10蛋白约为18 ku，主要以包涵体形式表达。将CyHV3-IL10包涵体进行变性和复性，经分子筛凝胶柱层析纯化获得了纯度较高的重组CyHV3-IL10蛋白，利用CyHV3-IL10重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）筛选，获得了2株亲和力强的抗体，并利用激光共聚焦技术和Western blotting对抗体进行了鉴定。结果表明，FITC标记的单克隆抗体能够特异性识别HEK293细胞中表达的CyHV3-IL10重组蛋白和感染CyHV3的镜鲤脾和鳃组织中表达的CyHV3-IL10蛋白。CyHV3-IL10单克隆抗体的制备为后续研究CyHV3-IL10蛋白功能和建立CyHV3诊断方法奠定了基础，为CyHV3病毒检测试剂盒的研发提供了新思路。     

克氏原螯虾白斑病毒株(WSSV-Cc)基因组的一个印迹

从自然感染、濒死的克氏原螯虾中分离出的白斑病毒株(Cambarus clarkii whispovirus,WSSV-Cc或Cc株)是一株基因组较小的新毒株。为寻找白斑病毒进化过程在基因组中留下的印迹,进行了显微和超微观察、基因组架构与系统发育分析及相关基因扩增等研究。选择Cc株74L、86L、87R、88R、92R和95R的6个基因,与8个白斑病毒株的同源基因所编码蛋白序列构建进化树,结果可分为克氏原螯虾病毒(Cc株、CN02株、Pc株)和海水对虾病毒(CN株、CN01株、CN03株、CN04株、TW株和KR株) 2支。再对不同毒株的同源蛋白进行多重序列比对,显示Cc-87R是与海水对虾病毒株同源蛋白差异显著、缺失跨膜区(TMD)及其相邻287 aa序列、但仍有完整PI3K_rbd结构域的病毒膜蛋白。进一步设计和使用87R-F/87R-R和238-F/87R-R两对引物,分别以淡水小龙虾病毒Cc株和海水对虾病毒CN株的基因组为模板进行核酸扩增,结果从Cc株模板中扩增到大小为709 bp,含Cc-87R全部序列的核酸片段;而从CN株的模板中却扩增到大小分别为1 600和4 810 bp,仅含Cc-87R部分序列的核酸片段,为Cc-87R是Cc株基因组中一个序列结构独特的印迹提供了实验证据。这一发现将有助于克氏原螯虾白斑病毒病原的检测及其流行趋势预警。     

不同渗透压条件下金钱鱼肾原代细胞的差异蛋白分析

为了研究海水鱼类肾脏的渗透压调节功能,以金钱鱼肾原代细胞作为研究对象,使用低渗、等渗和高渗培养基处理细胞24 h,通过Label-free定量法进行蛋白质组学分析,质谱定性得到蛋白质共计3 787个,低渗组与等渗组比较,得到显著差异蛋白14个;高渗组与等渗组比较,得到显著差异蛋白31个。筛选标准为Ratio+/-2,且P 0. 05。对差异表达蛋白进行Gene Ontology(GO)功能注释,GO富集分析以及蛋白质聚类分析,并挑选了与细胞骨架、能量合成以及蛋白结合相关的蛋白质进行了mRNA水平的定量检测,从基因和蛋白水平了解肾脏细胞在渗透调节中的变化。结果显示:低渗组中,细胞骨架相关蛋白质受到的影响较大,其中包括微管蛋白α-4A链、微管蛋白β链、肌球蛋白-11以及typeⅠcytoskeletal 18-like,而高渗组中差异显著的蛋白质多为细胞外间质蛋白,如纤连蛋白、胶原蛋白等。因此推测低渗刺激后,胞内渗透压高于胞外渗透压,细胞立即膨胀并大量表达细胞骨架蛋白应对低渗刺激,适应细胞形态的改变;而高渗刺激下,细胞处于失水状态,形态骤缩,影响细胞间的粘连,而fn、plod2和arf1升高表明,细胞正在修复受损蛋白。本研究从细胞水平初步分析了金钱鱼肾脏在不同渗透压刺激下的应答机制,为研究细胞水平的渗透压调节机制提供了新的观点。     

中国水产动物病毒学研究概述

本研究简要概述了过去几十年来中国水产养殖动物病毒学的代表性研究成果,主要涉及鱼类病毒、虾类病毒、两栖和爬行动物病毒等。此外,本研究还展望了水产动物病毒学研究的发展趋势,以有助于加深对中国水产养殖动物病毒学研究现状和未来发展的认识。     

金钱鱼促性腺激素受体基因克隆及其在性腺发育不同时期mRNA表达水平的分析

为了解金钱鱼促性腺激素受体基因(GtHRs)在金钱鱼性腺发育中的作用,采用反转录PCR(Rt-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)首次克隆了金钱鱼卵泡刺激素受体(FSHR)和促黄体生成素受体(LHR)的cDNA序列全长。FSHR的cDNA全长2538 bp,编码702个氨基酸,LHR的cDNA全长3315 bp,编码722个氨基酸,它们都含有属于糖蛋白激素受体(GHR)家族的典型跨膜螺旋结构区域(TM helix)。同源性分析显示金钱鱼GtHRs与欧洲鲈的相似性最高,且GtHRs在进化中具有一定的保守性。性腺不同时期表达分析表明,在卵巢Ⅰ期时,FSHR高水平表达,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时在较低水平表达。在精巢中,FSHR的表达水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期逐渐升高并在Ⅲ期达到最高,Ⅳ期开始下降。LHR在金钱鱼卵巢和精巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期低水平表达,在Ⅳ期表达水平达到最高。研究表明,FSHR在金钱鱼性腺发育早期扮演重要作用,LHR与卵子和精子的成熟有关。