两种芽孢杆菌体外体内拮抗气单胞菌的试验

将蜡样芽孢杆菌Y1和巨大芽孢杆菌BM1259混合培养,结合平板活菌计数、抑菌活性测定及体内拮抗试验,研究其对水产动物气单胞菌的抑菌效果。体外拮抗试验结果表明,这两种芽孢杆菌均能明显抑制嗜水气单胞菌NQ的增殖,抑制率分别为53.74%和56.12%。不同温度下的抑菌活性试验显示,2种芽孢杆菌的抑菌活性温度分别为32℃和29℃。体内拮抗试验结果表明,巨大芽孢杆菌能显著降低异育银鲫肠道气单胞菌的数量。提示巨大芽孢杆菌可作为潜在的水产专用微生态制剂。     

长江所“一种甲基营养型芽孢杆菌YFI-1及在制备水产细菌抑菌剂中的应用”获国家发明专利授权

正日前,中国水产科学研究院长江水产研究所薛明洋等科研人员申请的"一种甲基营养型芽孢杆菌YFI-1及在制备水产细菌抑菌剂中的应用"获国家发明专利授权,专利号为ZL201910767184.7。该发明中的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1对水产病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌均具有良好的抑制效果,可以作为     

带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究

从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育进化分析,菌株JFL15与暹罗芽孢杆菌的同源性最高,达98.05%,初步鉴定为暹罗芽孢杆菌。对暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液进行研究发现,暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液对酶、温度、酸碱度和紫外线均不敏感,且发酵产物储存较长时间后仍具有较强抑菌活性。     

解淀粉芽孢杆菌HE活性成分鉴定及抗菌特性分析

为明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HE发酵液中的活性成分及抗菌特性,根据解淀粉芽孢杆菌发酵液抑菌活性稳定性,用PCR检测脂肽合成相关的基因,再采用UPLC-Q-TOF-MS对活性物质进一步分析;用二倍稀释法测定脂肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并从显微结构上来探讨其抗菌作用。稳定实验表明该菌株产生抑菌活性物质对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性;4对引物的扩增产物经过克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌HE基因组含有ituA、fenB、sfP、mycB的脂肽合成相关基因;液质联用分析发现脂肽粗提物中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素;抑菌圈法测定抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为137.97μg·mL~(-1);显微特征表明脂肽可以导致嗜水气单胞菌细胞膜塌陷和孔洞。该研究结果可为解淀粉芽孢杆菌活性代谢产物结构鉴定和安全性评价提供参考。     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

渔源解淀粉芽孢杆菌CQN-2菌株培养基及发酵条件优化

CQN-2是一株具有抗病、促生长等多种功能的肠道内源性解淀粉芽孢杆菌。为研究其最佳培养条件,从而为规模化生产发酵提供依据,本文以菌体生物量为指标,采用单因素试验和正交试验对CQN-2菌株的最适培养基及发酵条件进行优化。结果表明,CQN-2菌株的最适碳源为可溶性淀粉,最适氮源为细菌学蛋白胨,经优化后的最佳培养基配方为可溶性淀粉20 g/L、细菌学蛋白胨30 g/L、糖蜜50 g/L、KH_2PO_4 0.5 g/L、MgSO_4 0.5 g/L、NaCl 0.3 g/L、Mn~(2+) 5 mmol/L、Al~(3+) 1 mmol/L;最佳发酵培养条件为初始pH值7.0,接种量为3%、装液接种量25 mL/250 mL;使用优化后的培养基将CQN-2接种于5 L发酵罐进行高密度发酵培养36 h后的活菌数为3.03×10~(12) CFU/mL。     

草鱼体表嗜水气单胞菌拮抗细菌S190的分离鉴定及生物学特性研究

由采集的草鱼体表细菌中，分离筛选到1株抗嗜水气单胞菌较强的菌株S190。通过对该菌株个体和群体形态特征观察、生理生化特征测定及16SrDNA序列分析，初步确定为Jeotgalicoccus psychrophilus S190。杯碟法拮抗试验表明，S190对嗜水气单胞菌有较强的抑制作用；最适作用条件为25℃、pH8．0。该菌株对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌也表现出一定程度的抑制作用。生物学特性研究表明：S190生长最适碳源为1％的糊精，氮源为0．01％的酵母粉，磷源为0．01mol／L的K2HPO4；培养温度25℃，pH10，NaCl浓度5％（m／V），接种量3％（V／V），装液量以250ml三角瓶装250ml生长最好。     

嗜水气单胞菌胁迫对黄鳝肝脏等四种组织器官抗菌活性的影响

为研究黄鳝机体对细菌的免疫应答规律及其抗病机理,用不同浓度的嗜水气单胞菌感染健康黄鳝,采用抑菌圈法,检测不同处理时间黄鳝肝脏、肾脏、肠和皮肤等4种组织器官中抗菌肽粗提物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性。结果显示:胁迫后,黄鳝4种组织器官的乙酸提取物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等3种菌均具不同程度的抗菌活性,但对枯草芽孢杆菌均无明显抑制作用。各组织器官的抗菌活性规律大体表现为:对金黄色葡萄球菌的抑制作用对大肠杆菌的抑制作用对嗜水气单胞菌的抑制作用。对嗜水气单胞菌的抑制作用表现为:随着感染时间的延长,肾脏提取物的抗菌活性有所增强,皮肤提取物的抗菌活性有所减弱。对大肠杆菌的抑制作用表现为:皮肤提取物最强,肠提取物最弱,随着感染时间的延长,皮肤的抗菌活性变弱。对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现为:肾脏和肝脏提取物较强,肠和皮肤提取物较弱。     

益生菌D-1液体发酵工艺的研究

为提高菌体的得率和芽孢转化率,进行了菌株D1最佳培养条件参数和培养基优化的研究及测定此条件下的生长曲线。通过研究发酵温度、接种量、培养基初始pH、溶解氧等因素对菌株D1生长的影响,确定最佳培养条件为:培养温度30℃,培养基初始pH7.0,接种量5%(相对摇瓶装液量),装液量100mL/500mL。在发酵基础培养基成分保持不变的情况下改变氮源、碳源、生长因子、无机盐单因子进行单因子试验,采用L9(3)4正交表设计实验,进行培养基优化,确定最佳培养基配比为玉米淀粉2%,蛋白胨2.5%,NaH2PO40.8%,玉米浆1.5%,MgSO4·7H2O0.05%,3.08%MnSO4水溶液0.1%。在最佳培养条件下,用最优培养基测定了菌株D1的生长曲线,并确定了菌株D1的最佳种龄为18～20h,生产收获时间为26h。     

饲用大豆肽生产菌株的初步筛选及发酵条件研究

通过发酵试验对三株芽孢杆菌进行筛选,并确定该菌株的最佳接种量、种龄和摇床速度。对其发酵条件进行优化,结果表明最适条件为:加水量94%、温度30℃、180r/min旋转摇床48h。发酵液的水解度达到15.9%,比优化前提高了1.92倍。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

大黄蒽醌提取物对罗氏沼虾抗鳗弧菌感染的研究

将罗氏沼虾随机分成5组,每组三个平行,每个平行约1000尾(个体均重1g左右),第1组为对照组,投喂基础日粮,另外4组为试验组,在基础日粮中分别添加0.05%、0.1%、0.2%、0.4%大黄蒽醌提取物,饲养6周后对罗氏沼虾进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染.测定生长以及0、12、24、48h血清和肝胰腺溶菌酶、丙二醛(MDA)、总抗氧化能(T-AOC)以及超氧化物歧化酶(SOD)等指标.生长试验表明,与对照组相比,0.1%组、0.4%组罗氏沼虾的增重率、特定生长率显著提高,饵料系数显著降低.攻毒试验Ⅰ表明,各组48h内罗氏沼虾血清溶菌酶活性、肝胰腺溶菌酶含量、血清T-AOC均呈先升高后降低趋势,其中它们的最大值分别出现于0.4%组的12h、0.2%组24h、0.1%组12h;肝胰腺SOD活力呈上升趋势,而血清MDA则一直下降.攻毒试验Ⅱ表明,大黄蒽醌提取物能有效地降低试验组罗氏沼虾的死亡率,提高免疫保护率,其中0.4%组的保护效果为最佳.因此,在饲料中添加大黄蒽醌提取物降低罗氏沼虾对病原的敏感性,增强机体抗病力,促进生长.     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

抑食金球藻对翡翠贻贝抗氧化酶系统的影响

本研究以单种抑食金球藻及其与亚心形四爿藻的混合藻为实验组,以亚心形四爿藻为对照,探究抑食金球藻对翡翠贻贝超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响。结果显示,抑食金球藻显著影响翡翠贻贝的SOD活性、MDA和GSH含量,各实验组均表现出诱导升高与抑制降低交替出现的规律。单种高、中浓度的抑食金球藻在短期(3 h)内即可对翡翠贻贝的SOD活性产生影响,混合藻组中的SOD活性上升较慢,说明亚心形四爿藻可以延滞氧化还原系统的反应时间。各实验组翡翠贻贝GSH含量在2 d内均显著低于对照组,且混合藻组与单种抑食金球藻组相差不大,提示亚心形四爿藻对抗氧化还原损伤并未起到明显的缓解作用。     

波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA还原酶差异比较

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异，本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28℃和4℃下的生长及三甲胺（TMA）、生物胺和挥发性盐基氮（TVB-N）的生成；通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因（torA），利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示，杀鲑气单胞菌在28℃生长较快，而波罗的海希瓦氏菌在4℃生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺，波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺，在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因，2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%，而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52，甘氨酸含量最高，而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74，丙氨酸含量最高，蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA 和鸟氨酸脱羧酶（DOC）基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见，波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌，其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强，与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

虾夷扇贝与风向标扇贝种间杂交的初步研究

针对虾夷扇贝在养殖过程中出现的问题,本研究以风向标扇贝和虾夷扇贝为亲本进行了种间杂交实验,培育出了虾夷扇贝（♀）×风向标扇贝（♂）（PY♀×PC♂）及风向标扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）（PC♀×PY♂）两种杂交一代,并对其早期发育及幼虫期和稚贝期生长进行了比较。结果显示,PY♀×PC♂杂交一代的受精率、孵化率和幼虫期的生长和存活率介于双亲之间,而壳高和壳长的生长均高于双亲,表现出显著的杂种优势;PC♀×PY♂杂交一代的受精率、孵化率、幼虫期生长和存活率均低于双亲,表现为杂种劣势。在养殖第1年,PY♀×PC♂杂交一代的壳高、壳长、壳宽和体质量增长率均高于双亲,杂种优势显著。研究表明,卵子来源对后代的表现具有极其显著的影响,以雌性虾夷扇贝与雄性风向标扇贝进行种间杂交从而改良虾夷扇贝种质是可行的。     

罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响

通过围隔实验比较罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP)、罗氏沼虾+浮萍(水面覆盖率5%)(PP)、罗氏沼虾+鲢(PF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+鲢(PMF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢(PMPF)。养殖64 d后,测定不同模式中浮游植物和三大类浮游动物(轮虫、枝角类及桡足类)的种类和数量。结果显示,上述6种模式中浮游植物共同优势种有4种,但优势度指数最大的浮游植物不同,MP组是锥囊藻属,有浮萍的PP和PMP组均为细小平裂藻,混养鲢的PF、PMF和PMPF组均为针杆藻。不同养殖模式无共同的浮游动物优势种。养殖模式对浮游生物密度具有显著影响,PF组浮游植物密度最高,MP组浮游植物密度最低,PF组浮游植物密度比MP、PP和PMP组分别高78%、53%和61%。相反,浮游动物密度MP组最高,PF组最低。混养鲢的PF、PMF和PMPF组浮游动物密度显著低于其他3组。研究表明,罗氏沼虾养殖中混养鲢可增加浮游植物密度而降低浮游动物密度,浮萍和鲢影响池塘优势种。