荧光定量PCR检测洪湖碘泡虫寄生异育银鲫组织器官的偏好

为了阐明洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)在隐性感染异育银鲫(Carassius auratus gibelio, Bloch)不同组织器官中的分布情况, 本研究采集曾发生过喉孢子虫病养殖池塘的 2 龄健康异育银鲫的鳃(丝)、伪鳃、中肾、头肾、 肌肉、脾脏、肝脏、卵巢、血液等 9 个组织器官, 采用荧光定量 PCR 检测分析了不同组织器官的感染率和相对感染强度。结果显示, 所采集的 30 尾异育银鲫都没有明显临床症状, 但鱼体的洪湖碘泡虫感染率为 100%, 均为隐性感染个体; 各组织器官间的感染率存在较大差异, 除肌肉未检出外, 感染率从高到低依次为: 伪鳃(100.0%)、卵巢 (83.3%)、鳃(73.3%)、脾脏(70.0%)、中肾(36.7%)、头肾(23.3%)、肝脏(10.0%)、血液(6.7%)、肌肉(0)。不同组织器官的相对感染强度由高到低依次为: 伪鳃(14.4349±70.0529)、卵巢(0.9556±1.5627)、脾脏(0.3644±0.7854)、鳃 (0.3339±0.2682)、头肾(0.2722±0.3761)、中肾(0.0379±0.1055)、肝脏(0.0019±0.0022)、血液(0.0012±0.0011)。研究表明, 洪湖碘泡虫可系统感染异育银鲫多个组织器官, 其中, 伪鳃感染率和感染强度最高, 可以作为该病早期检测和疫病监测的首选组织器官。     

异育银鲫寄生洪湖碘泡虫的鱼卵传播途径

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)是引起异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)“喉孢子病”的重要病原, 每年导致养殖苗种和成鱼大量死亡。本研究通过隐性感染异育银鲫母本人工受精、实验室条件下受精卵孵化和幼鱼培育, 采用单管半巢式 PCR、荧光定量 PCR 和寡核苷酸荧光原位杂交等检测手段进行亲本、卵和幼鱼等环节的检测分析, 探究异育银鲫寄生洪湖碘泡虫是否存在经卵传播途径。结果表明, 所采用的 34 尾异育银鲫母本(A1~A22, B1~B12)的洪湖碘泡虫隐性感染率达 50%~75%, 其中, 卵和伪鳃检出率高于卵巢组织样品; 特异性寡核苷酸探针荧光原位杂交在隐性感染母本的卵巢、伪鳃、肾、脾组织检测到洪湖碘泡虫前孢子生成阶段营养体; 实验室条件下阳性母本所产的卵经孵化和培育出的幼鱼 15 dph 和 30 dph 样品可以检出阳性(A1、A18、B8 和 B9); 荧光原位杂交显示 15 dph 幼鱼在伪鳃、鳃和肾脏组织检测出阳性信号。本研究进一步揭示了异育银鲫寄生洪湖碘泡虫存在经鱼卵传播途径; 研究结果可为相关疾病制定防控措施奠定重要的理论基础。     

白藜芦醇对脂多糖诱导草鱼肾脏细胞炎症的抑制作用

为评价白藜芦醇(resveratrol)对脂多糖诱导损伤草鱼(Ctenopharyngodon idella)肾脏细胞(CIK)的保护作用,本研究通过脂多糖(LPS)诱导细胞炎症损伤,测定和分析白藜芦醇对CIK细胞抗氧化因子活性和抗氧化、炎症相关基因表达变化的影响。结果表明,与对照组相比,LPS处理导致CIK细胞活力降低(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)活性升高(P<0.05),降低了细胞内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并导致还原型谷胱甘肽(GSH)浓度降低(P<0.05)和丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05)。此外,LPS处理能引起CIK细胞的CAT、TNF-α、IFN-γ、IL-1基因表达显著上调(P<0.05),而对IL-10和SOD基因的转录表达无显著影响(P>0.05)。通过向培养基中添加白藜芦醇(4μg/mL)可以显著减弱LPS对CIK细胞造成的损伤,维系细胞抗氧化能力,抑制TNF-α等炎症相关基因的表达(P<0.05),促进CAT基因的表达(P<0.05)。研究认为白藜芦醇对LPS造成的CIK细胞损伤有明显的干预作用,主要原因可能是由于白藜芦醇对CIK细胞的抗氧化能力的改善以及对促炎因子表达的抑制。本研究可为白藜芦醇应用于鱼类炎症、氧化损伤相关疾病的防治提供理论依据。     

大黄素、维生素C及其配伍对团头鲂感染嗜水气单胞菌后生理生化指标的影响

为综合评价大黄素、高剂量维生素C及其配伍对团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih)抗嗜水气单胞菌感染能力的影响,选取1 200尾健康的团头鲂,体质量为(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮,另外3组在基础日粮中分别添加60mg/kg大黄素、700 mg/kg维生素C、60mg/kg大黄素+700mg/kg维生素C(配伍组).饲养60 d后,经腹腔注射感染嗜水气单胞菌,并在攻毒前后检测团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏2种热休克蛋白70s(HSP70s)mRNA的表达水平;另从各池中取10尾鱼进行同样的攻毒试验,统计攻毒后各时间点鱼的累积死亡率.结果表明,攻毒后,与对照组相比,大黄素、维生素C组不同程度地提高了血清总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及HSC70和HSP70 mRNA的表达水平,降低了血清皮质醇(COR)、血糖(GLU)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、甘油三酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的水平;配伍组中,这些指标的变化趋势虽与上述类似,但大多与对照组的差异不显著(P＞0.05),且未表现出协同增效作用.此外,各组鱼血清胆固醇(CHOL)的含量在攻毒前后的差异均不显著(P＞0.05).统计也表明,大黄素和维生素C组鱼的累积死亡率在攻毒后24 h、48 h均显著低于对照组(P＜0.05),而配伍组试验鱼的累积死亡率与对照组差异均不显著(P＞0.05).由此可见,在基础日粮中添加大黄素60 mg/kg或维生素C 700 mg/kg,可提高鱼体的非特异性免疫力、抗氧化能力以及2种HSP70s mRNA的表达水平,增强鱼体抗病原菌感染的能力.二者配伍则效果不佳.     

厚朴酚对嗜水气单胞菌感染异育银鲫的抗氧化因子及抗炎TLR-5/MyD88通路基因表达的影响

为了评价厚朴酚治疗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的效果, 本研究在构建异育银鲫(Carassius auratus gibelio)感染模型的基础上, 分析了厚朴酚对感染结果、血液生化指标、肝脏抗氧化因子、组织病理和炎症相关基因表达的影响。实验设置空白对照组、感染组、2 mg/kg、8 mg/kg、32 mg/kg 3 个厚朴酚处理组。结果显示, 厚朴酚处理能有效减少感染鱼类的死亡, 且厚朴酚处理组对异育银鲫的相对保护率分别为 60.75%、71.85%、 59.95%。与感染组相比, 给予不同浓度的厚朴酚治疗后, 谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶 (aspartate aminotransferase, AST)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)显著下调, 总蛋白(total protein, TP)和白蛋白(albumin, ALB)含量显著上升(P<0.05); 过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 活性显著提高, 还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量显著提高, 丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)含量显著下降 (P<0.05)。组织病理结果显示, 厚朴酚在一定程度上缓解肝脏和脾脏的充血, 改善肾脏和肠道的细胞坏死。在炎症相关基因的表达方面, 8 mg/kg、32 mg/kg 浓度下的厚朴酚处理组能显著下调 MyD88、NF-κB 和 TNF-α 基因的表达量, 以及明显提高 TLR-5 基因的表达量(P<0.05)。由此表明, 厚朴酚能减少嗜水气单胞菌感染引起的异育银鲫死亡, 降低异育银鲫组织的氧化损伤, 下调机体炎症相关基因的表达。该研究结果可为厚朴酚未来应用于生产实践提供一定的理论基础。     

团头鲂养殖池塘维氏气单胞菌的致病性耐药性及在不同生态位间的差异

从江苏省常州市团头鲂养殖池塘鱼体内、外环境(内环境包括鱼体肠道、体表黏液、鳃、腹腔、肝脏、肾脏等,外环境包括水体、底泥、浮游生物等)分离鉴定了56株维氏气单胞菌(Aeromonas ueronii),分析56株维氏气单胞菌的致病性、毒力基因及耐药性,并比较了不同生态位间的差异.结果表明:(1)维氏气单胞菌具有一定的致病性,56株维氏气单胞菌中使团头鲂的48h死亡率在40％以上的菌株有26株,为团头鲂细菌性出血病的病原菌之一.(2)细胞兴奋性肠毒素基因alt、溶血索基因hly的检出率分别为26.8％、48.2％,具有2种毒力基因的菌株占19.6％;(alt+、hly+)、(alt+、hly-)、(alt-、hly+)、(alt-、hly-)4种毒力基因菌株型48h致死率分别为41.8％、35％、32.3％、29.2％,表明死亡率与这2种毒力基因可能存在一定的正相关性.(3)维氏气单胞菌对大多数抗生素耐药,对氨苄西林完全耐药,对复方新诺明、诺氟沙星、洛美沙星的耐药率也分别高达94.6％、94.6％、91.1％,只对多黏菌素、庆大霉素较为敏感,敏感率分别为64.3％、48.2％.(4)不同生态位菌株的毒力基因比较结果显示,鱼体上菌株2种毒力基因的携带率(alt30.4％、hly47.8％)大于外界环境毒力基因的携带率(alt10％、hly40％);不同生态位菌株的抗药性呈现出一个特点,即鱼体上分离到的菌株耐药率(67.2％)要明显大于外环境中菌株对药物的耐药率(40％).     

饲料中脂肪水平对团头鲂幼鱼生长性能、血清生化指标及黏蛋白基因表达的影响北大核心CSCD

本试验旨在研究饲料中不同脂肪水平对团头鲂幼鱼生长性能、血清生化指标及黏蛋白基因表达的影响。试验选取540尾初始体重为(10.0±0.5)g的团头鲂幼鱼,随机分为6组,每组3个重复,每个重复30尾鱼,分别投喂脂肪水平为2.29%、4.29%、6.29%、8.29%、10.29%和12.29%的等氮等能试验饲料。饲养8周后检测鱼体生长指标、血清生化指标和表皮、肠道中黏蛋白基因的表达。结果表明:1)6.29%和8.29%组的增重率(WGR)显著高于其他组(P<0.05),饲料系数(FCR)显著低于其他组(P<0.05)。2)12.29%组血清皮质醇含量及谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性最高,显著高于2.29%、4.29%、6.29%和8.29%组(P<0.05),但与10.29%组没有显著差异(P>0.05)。3)8.29%组鱼体肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著高于2.29%组(P<0.05);而谷胱甘肽还原酶(GR)活性在6.29%组最高,除8.29%组外,显著高于其他各组(P<0.05);丙二醛(MDA)含量在6.29%组最低,显著低于2.29%和12.29%组(P<0.05)。4)12.9%组肠道黏蛋白2(Muc2)基因表达量显著高于其他各组(P<0.05),8.29%组表皮黏蛋白5b(Muc5b)基因表达量与12.29%组没有显著性差异(P>0.05),但显著高于其他各组(P<0.05)。5)病原菌感染试验表明,2.29%和12.29%组死亡率较高,6.29%和8.29%组死亡率较低,且显著低于其他各组(P<0.05)。综上,在本试验条件下,饲料脂肪水平在6.29%~8.29%时,团头鲂幼鱼生长性能、抗病力和表皮黏蛋白Muc5b基因表达量最高。     

鱼类黑素皮质素受体(MCR)研究进展

 黑素皮质素受体(melanocortin receptor, MCR)家族属于最小的G蛋白偶联受体家族之一, 具有7个跨膜的α螺旋, 在脊索动物生理活动中具有重要作用。在哺乳类及四肢类动物的MCR研究中共发现有5种不同功能的同源基因(MC1R、MC2R、MC3R、MC4R、MC5R), 它们在机体色素沉积、摄食行为、能量平衡、类固醇合成和性行为等方面发挥重要功能。近年来, 鱼类MCRs的研究逐渐得到学者们的普遍关注, 一些鱼类的MCRs亚型相继被克隆, 并对其功能进行了分析。鱼类作为脊椎动物进化中较为原始的类群, 具有与哺乳动物MCRs相似的保守特征, 同时也具有其特殊性。对鱼类MCRs的深入研究有利于揭示MCRs在脊椎动物中的进化规律, 掌握MCRs对鱼类生理功能的调控特征, 为促进渔业生产提供科学理论基础。本文主要对近年来鱼类MCRs的克隆、分子特征、药理学及生物学功能等方面的研究进展进行简要的综述。

     

团头鲂促肾上腺皮质激素释放激素受体基因序列特征及表达分析

促肾上腺皮质激素释放激素受体(corticotropin-releasing hormone receptor,CRHR)是鱼类下丘脑–垂体–头肾调控轴上的重要应激调节因子。本研究通过c DNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)CRHR1 m RNA全长序列,应用生物信息学方法对其序列特征进行解析;同时采用荧光定量PCR技术分析了团头鲂CRHR1的组织分布图谱及外源性皮质醇注射模拟应激处理下团头鲂CRHR1 m RNA的表达变化。研究结果表明,CRHR1 m RNA序列开放阅读框(open reading frame,ORF)为1290 bp,编码429个氨基酸。团头鲂CRHR1氨基酸序列与鲤科鱼类的CRHR1氨基酸序列同源性最高;该受体具有7次横跨膜结构和氨基端激素受体结构域。CRHR1在垂体中表达量最高,其次为下丘脑,在心脏、肝、脾等组织中表达丰度较低。经外源性皮质醇注射后,实验组血糖和血清皮质醇显著高于对照组,在处理2 h后达到峰值;实验组血清ACTH水平与对照组差异总体不显著,但呈现先升高后下降。应激处理后,CRHR1转录水平在4种组织中的表达变化存在差异;垂体中CRHR1在早期出现明显的表达抑制,在下丘脑中则呈现先缓慢升高后缓慢下降的趋势,而心脏和头肾中CRHR1在早期则表现出表达迅速上调而后缓慢下降的趋势。本研究进一步丰富了CRHR在鱼类研究方面的基础资料,为鱼类应激调控提供了理论基础。     

嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布

利用具有绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌(WJ-8G FP)对团头鲂(Megalobrama amblycephala)进行浸泡攻毒试验,探究温度对浸泡感染后嗜水气单胞菌在团头鲂各组织分布的影响。实验设立A组(水温25℃),B组(水温32℃),C组(水温25℃),其中C组为对照组。用菌株WJ-8G FP对实验组A、B进行浸泡攻毒,试验组C不进行攻毒处理,攻毒后分别于2 h、4 h、8 h、12 h、24 h采集各组鱼血液、脾、肾、鳃、肠道、肌肉,培养法统计分析各组织器官上的荧光细菌数量。实验结果显示,在各取样时间段实验组A(25℃)和实验组B(32℃)团头鲂各组织在均能检测到荧光嗜水气单胞菌,对照组未检测到嗜水气单胞菌;最高菌量出现在鳃,且鳃上嗜水气单胞菌数量显著大于其他组织(P0.05),其次是脾、肾;组织内的菌量随时间大体呈现先上升后下降的趋势;B实验组中各组织菌量显著大于A实验组(P0.05)。研究结果表明,鳃是嗜水气单胞菌浸泡感染团头鲂的主要组织器官,与25℃相比较,在水温32℃时团头鲂被嗜水气单胞菌感染的风险更高。