浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。     

云南省猪圆环病毒 2 型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒 2 型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南 PCV2 毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用 PCR 方法对云南省 11 个地区 783 份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2 病原学检测,对 6 份 PCV2 阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用 DNAStar 软件比对分析全基因和 ORF2 氨基酸序列,使用 MEGA 软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的 PCV2 阳性率为 48.73%;共测得 6 株 PCV2 全基因组序列,其中 5 株为 1 767 bp, 1 株为 1 768 bp;经遗传发育分析可知,有 PCV2a 亚型 2 株、PCV2b 亚型 2 株、PCV2d 亚型 2 株;6 株 PCV2 毒株同源性在 94.6%~99.9% 之间,与 GenBank 数据库中 20 条参考株同源性在 91.4%~99.8% 之间;6 株 PCV2 亚型的 ORF2 都有其典型的氨基酸位点,PCV2a 毒株在第 80（V80L）氨基酸位点突变为与 PCV2（b/d）一致,PCV2b 毒株在 59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）等氨基酸位点突变与 PCV2d 一致。【结论】PCV2 在云南猪群中普遍存在,以 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d 这 3 个基因亚型共存为主,且 PCV2（a/b）有向 PCV2d 突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染 PCV2。     

华南地区猪圆环病毒3型分子流行病学研究

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒类型,为了解PCV3在华南地区的分布及其分子流行病学,应用荧光定量PCR方法对华南地区的临床样品进行检测,然后对PCV3阳性样品进行全基因组扩增和测序,将获得的7株PCV3核酸序列与国内外参考毒株进行遗传变异分析。结果表明,华南地区送检的临床样品和猪场的PCV3阳性率分别为46.3%和69.2%,7株PCV3毒株与国内外的参考毒株同源性为97.4%~99.8%,而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为96.6%~99.8%和96.7%~99.5%。由此可见,PCV3在我国华南地区已经广泛存在。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

5株PCV2四川株全基因组的克隆与遗传进化分析

【目的】了解目前四川省猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨PCV2感染的控制对策。【方法】根据GenBank中发表的PCV2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的PCV2感染病例材料中的5株PCV2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的PCV2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】5株PCV2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点(ORC)典型结构。序列比对和进化分析显示,5株PCV2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%~99.9%,97.5%~99.6%,99.4%~100%和96.2%~100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%~99%,99.6%和91.5%~100%;与47条参比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株PCV2与国内一些新出现的PCV2毒株亲缘关系较近,且均属于PCV2d基因型毒株。【结论】5株PCV2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

猪圆环病毒2型HB-MC1株全基因组序列测定与分析

参照发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对2014年从河北省满城县某发病猪场分离到的1株PCV2(命名为HB-MC1)的全基因组进行了序列测定。应用DNAStar序列分析软件,对所测序列与GenBank中登录的PCV2序列进行同源性比较,结果显示,HBMC1株的基因组全长为1 767nt,其ORF1序列与GenBank登录的一些具有代表性的PCV2参考序列同源性高达97.2%~99.9%,其ORF2同源性在89.9%~99.6%之间。进化树分析结果显示,该毒株为PCV2d亚型,毒株部分核苷酸位点显示其属于强毒力毒株。研究结果揭示了HB-MC1株基因组特征与基因亚型,丰富了PCV2的基因组信息数据。     

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因组及ORF2的克隆与结构分析

参考GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)基因的全序列,利用反向PCR技术设计一对特异引物,用PCR方法扩增从本室分离的猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因,另设一对引物扩增编码ORF2完整基因,将它们分别连接到pMD 18-T载体,筛选获得重组阳性质粒并对其测序分析。结果表明,所克隆的GX-FSH株全基因序列与Gen-Bank上已发表的部分PCV2毒株全基因序列同源性在94.6%~99.4%之间;相应ORF2开放阅读框的核苷酸同源性在90.0%~99.1%之间,氨基酸序列同源性为90.1%~98.7%;利用生物学软件对ORF2蛋白质结构特征分析,结果提示其成熟蛋白二级结构为β类结构。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析（英文）

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在PK15细胞上增殖,特异性PCR检测可扩增出特异性片段,经PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%~96.8%;与AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ和AF055392属于基因型PCV2a,与PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区PCVAD的防控提供了理论依据。     

猪圆环病毒3型河北株全基因组序列特征和遗传进化分析

【目的】扩增猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列,对其进行序列特征及遗传进化分析.【方法】以PCV3阳性样品为模板,利用两对引物扩增全基因组片段并测序,通过DNA Star和MEGA-X软件进行遗传进化分析.【结果】发现1株新PCV3毒株(GenBank登录号:MK105924),PCV3 Cap蛋白为3b亚型,与河北省9株PCV3 Cap蛋白的同源性在97.8%～99.8%;所获得的PCV3与PCV1和PCV2全基因组序列的同源性均小于50%,遗传进化树分析3种PCV处于不同的分支,表明其属于不同的基因型;与国内外其他43株PCV3全基因组序列的同源性在98.7%～99.3%,其中与俄罗斯PCV3毒株(GenBank登录号:MG679916)的同源性最高,为99.3%,表明不同PCV3毒株之间的全基因组序列的同源性很高,尚未发现明显的变异;与GenBank上已发表的全部国内外174株PCV3的全基因组序列进行遗传进化树分析,发现全球PCV3及其亚型的分布有地域的差异.【结论】获得1株新PCV3毒株,其与PCV1、PCV2属于不同的基因型;不同PCV3毒株之间存在着较高的同源性;全球PCV3及其亚型的分布与地域有一定的关系.     

Ⅱ型圆环病毒山东泰安株的分离鉴定及系统进化分析

采用双抗体夹心ELISA方法和PCR技术对来自山东泰安的病猪组织病料进行猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)检测。将检测为阳性的病料悬液接种无PCV1污染的PK-15细胞进行病毒分离,获得一株PCV2,命名为猪Ⅱ型圆环病毒山东泰安株(PCV2 sdt)。间接免疫荧光试验(IFA)检测可见接种病毒细胞中散在特异性荧光。提取全基因组为模板,进行病毒基因组1号开放阅读框(ORF1)、2号开放阅读框(ORF2)和全基因组序列扩增,得到长度分别约为999bp、749bp和1767bp左右的产物条带。将产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-ORF1、pMD18-T-ORF2和pMD18-T-PCV2。测序结果显示,所分离病毒的ORF1、ORF2和全基因组序列长度分别为945bp、702bp和1767bp。DNAStar生物学软件分析发现,PCV2分离毒株与参考株的全基因组同源性介于95.4%~98.8%之间,ORF1的同源性介于97.0%~98.8%,ORF2的同源性略低,介于91.9%~98.4%之间。     

猪圆环病毒2型广东分离株的基因序列分析

【目的】本文研究了广东猪圆环病毒2型(PCV2)基因的遗传变异。【方法】采集来自不同猪场疑似PMWS的组织样品15份,用PK-15细胞增殖病毒,并进行间接免疫荧光试验鉴定,采用PCR方法扩增PCV2全基因组序列,分析其核苷酸和氨基酸序列的变异情况。【结果】GD-1和GD-2属于PCV2d亚型,其基因组由1767个核苷酸组成;GD-3,GD-4和GD-5属于PCV2a亚型,基因组由1768个核苷酸组成。5个分离株的核苷酸序列同源性为95.0%~99.9%;PCV2分离株ORF1的核苷酸和氨基酸序列高度保守,其同源性分别为96.8%~100%和99.4%~100%;GD-1和GD-2由702个核苷酸组成,编码233个氨基酸,GD-3、GD-4和GD-5由705个核苷酸组成编码234个氨基酸,5个分离株ORF2的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9%~99.9%和88.0%~100%。【结论】广东省确实存在PCV2,但可能存在由PCV2b到PCV2d的变异。因此,有必要进一步研究PCV2基因变异对其致病性与Cap蛋白抗原性的影响,为培育和筛选更为有效的疫苗株奠定基础。     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析。【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析。【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2 000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性。PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%。系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型。【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及其全基因组序列分析

为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株。通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6%。挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析。结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2%~98.3%,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6%。系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型。     

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。     

猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMW S)组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析.结果表明,PCV2核苷酸序列较稳定,不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1 767 bp组成,彼此间核苷酸序列相似性达95.3%~99.8%,亲缘关系密切;与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70.1%~99.1%;与欧洲各地区毒株的相似性介于67.7%~98.8%;其中与美国的毒株(AY094619)差异性最大,介于69.4%~70.8%之间.