5株PCV2四川株全基因组的克隆与遗传进化分析

【目的】了解目前四川省猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨PCV2感染的控制对策。【方法】根据GenBank中发表的PCV2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的PCV2感染病例材料中的5株PCV2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的PCV2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】5株PCV2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点(ORC)典型结构。序列比对和进化分析显示,5株PCV2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%~99.9%,97.5%~99.6%,99.4%~100%和96.2%~100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%~99%,99.6%和91.5%~100%;与47条参比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株PCV2与国内一些新出现的PCV2毒株亲缘关系较近,且均属于PCV2d基因型毒株。【结论】5株PCV2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。     

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

云南省猪圆环病毒 2 型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒 2 型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南 PCV2 毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用 PCR 方法对云南省 11 个地区 783 份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2 病原学检测,对 6 份 PCV2 阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用 DNAStar 软件比对分析全基因和 ORF2 氨基酸序列,使用 MEGA 软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的 PCV2 阳性率为 48.73%;共测得 6 株 PCV2 全基因组序列,其中 5 株为 1 767 bp, 1 株为 1 768 bp;经遗传发育分析可知,有 PCV2a 亚型 2 株、PCV2b 亚型 2 株、PCV2d 亚型 2 株;6 株 PCV2 毒株同源性在 94.6%~99.9% 之间,与 GenBank 数据库中 20 条参考株同源性在 91.4%~99.8% 之间;6 株 PCV2 亚型的 ORF2 都有其典型的氨基酸位点,PCV2a 毒株在第 80（V80L）氨基酸位点突变为与 PCV2（b/d）一致,PCV2b 毒株在 59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）等氨基酸位点突变与 PCV2d 一致。【结论】PCV2 在云南猪群中普遍存在,以 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d 这 3 个基因亚型共存为主,且 PCV2（a/b）有向 PCV2d 突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染 PCV2。     

猪圆环病毒2型HB-MC1株全基因组序列测定与分析

参照发表的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对2014年从河北省满城县某发病猪场分离到的1株PCV2(命名为HB-MC1)的全基因组进行了序列测定。应用DNAStar序列分析软件,对所测序列与GenBank中登录的PCV2序列进行同源性比较,结果显示,HBMC1株的基因组全长为1 767nt,其ORF1序列与GenBank登录的一些具有代表性的PCV2参考序列同源性高达97.2%~99.9%,其ORF2同源性在89.9%~99.6%之间。进化树分析结果显示,该毒株为PCV2d亚型,毒株部分核苷酸位点显示其属于强毒力毒株。研究结果揭示了HB-MC1株基因组特征与基因亚型,丰富了PCV2的基因组信息数据。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

疑似PMWS患猪中PCV2的分离及全基因组序列分析

将疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪肺脏研磨、过滤除菌后接种无PCV1污染的PK15细胞,盲传4代,用PCR和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测。同时,利用所合成的PCV2全长的特异性引物进行病毒基因组全长的扩增及克隆、测序与比对分析。结果显示,不同传代细胞中PCV2核酸均为阳性,且PCV1特异引物检测为阴性,表明分离到的PCV2无PCV1污染,将该毒株命名为PCV2 B1株。序列分析表明,该病毒基因组全长1767 bp,与其他毒株的核苷酸同源性在95.4%~99.8%之间,ORF1的氨基酸的同源性在98.4%~99.7%之间,ORF2的氨基酸的同源性在89.7%~100%,核苷酸和氨基酸的序列与保定株BD1A(DQ910865)的序列最接近。     

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。     

猪圆环病毒2型贵州毒株的分离与鉴定

为分离和鉴定出猪圆环病毒2型(PCV2)贵州株,对送检的3份感染病料进行了分离,并将其分离毒株分别同步接种于PK-15细胞,再特异性扩增和克隆所分离毒株的全基因序列。结果表明:成功分离出3株PCV2贵州株,命名为GZ-QZ1株(1 767bp)、GZ-RH1株(1 767bp)和GZ-CS1株(1 768bp);3株PCV2贵州株全基因组之间的核苷酸相似性为94.6%～99.9%,其中ORF2核苷酸相似性为90.2%～99.9%;ORF2氨基酸一致性GZ-QZ1和GZ-RH1为100%,二者与GZ-CS1的氨基酸一致性均为88.1%。3株PCV2贵州株之间同源,但GZ-CS1存在一定变异。     

猪圆环病毒1型北京株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。     

烟草丛顶病毒云南不同分离物全基因组序列测定与分析

【目的】探明烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)云南不同分离物之间的遗传差异并完成系统进化分析。【方法】采用RT-PCR方法扩增获得云南不同地区10个TBTV分离物的全基因组序列。【结果】10个TBTV云南分离物的全基因组序列均为4 152 bp,基因组结构由4个开放阅读框(ORFs)构成,ORF2通过与ORF1发生-1位的移码(frameshift)表达融合蛋白,推测ORF1末端的GGAUUUU特征序列是确定ORF1与ORF2是否发生移码翻译的依据。各TBTV云南分离物全基因组序列的核苷酸序列同源性为84.9%~99.1%,其中来自德宏的分离物(TBTV-YDHo)变异最大。TBTV不同分离物间存在重组现象,且分离物之间亲缘关系与重组的发生有关,重组主要发生在变异较大的ORF1~ORF2区段。TBTV分离物的各区段中,ORF1和ORF1~ORF2变异最大,而ORF4和3'UTR较为保守。系统进化分析结果表明:TBTV作为幽影病毒属(Umbravirus)的成员之一,其与同属中的罂粟花叶病毒(Opium poppy mosaic virus,OPMV)亲缘关系最近,核苷酸序列同源性为61.1%~61.6%;与CMo V和CMo MV亲缘关系较远,同源性为54%~55.1%。除幽影病毒属外,TBTV与番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)其他属的病毒核苷酸序列同源性为25.1%~49.8%;Tombusviridae中Umbravirus与香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)的RNA2亲缘关系最远,与其他病毒属成员的亲缘关系都相对较近。【结论】TBTV云南各分离物之间存在一定的分子变异,有的存在重组现象;TBTV与OPMV亲缘关系最近。     

猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析.结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt:同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中.说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性.     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析。【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析。【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2 000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性。PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%。系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型。【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高。     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析.【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析.【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性.PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%.系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型.【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高.     

1株猪圆环病毒3型全基因组克隆与序列分析

【目的】克隆获得1株猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列并进行序列分析.【方法】以PCV3阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增PCV3全基因组片段,随后进行克隆、序列测定与分析.【结果】扩增出1株PCV3全基因组片段,序列测定结果显示,这株PCV3全基因组大小为2000bp,与其他国内外14株PCV3的核苷酸同源性均达98.6%以上,表明获得1株PCV3全基因组序列,且不同PCV3之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性.PCV3与PCV1、PCV2之间的全基因组核苷酸同源性都低于50%.系统发育显示,3种PCV分别处于明显不同的分支,表明各自属于不同的基因型.【结论】获得1株PCV3全基因组序列,其与其他PCV3毒株之间的核苷酸同源性很高.     

猪圆环病毒Ⅱ型DT株的分离鉴定及动物模型建立

应用PCR方法对江苏省东台市某猪场送检的一头无名高热病死猪的腹股沟淋巴结及肺脏病料进行检测.结果表明:该病料中存在PCV2;病料转染PK-15细胞,盲传3代后,IFA方法检测结果显示有明显的特异性荧光.利用设计的一对特异性引物对PCV2-DT株(东台分离株)全长基因进行扩增,测序结果显示所扩增基因为PCV2全长基因,大小为1 767 bp,包括11个完整的开放阅读框(ORF).PCV2-DT分离株与其他20株PCV2分离株序列比较发现,核苷酸同源性都在95%以上,并与欧美株处于同一分支.PCV2-DTRep、Cap序列同国内分离的16株相比较,核苷酸序列同源性分别为97.5%~100%和94.2%~99.9%.氨基酸序列同源性分别为98.4%~99.7%和93.2%~99.6%.用PK-15细胞从病料中分离的细胞毒接种3头42日龄健康仔猪(血清学检测无PCV1、PPV、PRV等感染),于首次接毒后的第10天出现发热、咳嗽、水样腹泻等症状,食欲几乎废绝,出现了PM-WS症状,初步建立了PMWS动物模型.     

猪细小病毒1型河南流行毒株的遗传进化分析

【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品，利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株，经过全基因组测序，分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2021。通过分析同源性和构建遗传进化树分析PPV1全基因组、NS1基因、VP2基因的变异情况，并且比对分析NS1蛋白和VP2蛋白的氨基酸变异情况及非编码区基因缺失情况。【结果】2条序列的核苷酸相似性为99.9%;与46株国内外PPV1流行毒株全基因组的核苷酸同源性为93.5%～99.9%;NS1基因核苷酸同源性为98.6%～99.9%,NS1蛋白氨基酸同源性为98.2%～99.9%;VP2基因核苷酸同源性为98.4%～99.9%,VP2蛋白氨基酸同源性为98.3%～99.9%,说明本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性。本研究鉴定株与湖南及吉林毒株亲缘关系最近，而与河南原有毒株亲缘关系较远。在对NS1蛋白与VP2蛋白的氨基酸变异分析中发现，NS1蛋白发生6处突变，VP2蛋白发生7处突变，均在经典突变位点范围内，符合PP...     

猪圆环病毒2型厦门株-1的ORF2基因序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,设计合成1对引物,对PCV2厦门株-1(XM-1)的ORF2基因进行PCR扩增.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可清晰看见1条与设计相符的大小为729 bp的特异条带.提取该片段进行测序,并与国内外24株PCV2毒株的ORF2进行比较,发现得到的PCV2 XM-1的ORF2与广西PCV2分离株(AY556475)核苷酸和氨基酸序列同源性均达到100%,与其它PCV2毒株ORF2的同源性分别为91.6%-99.9%和88.9%-100%,表明厦门地区生猪已感染PCV2,PCV2的ORF2基因与其它毒株有所不同.