鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptorα,RORα)的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列(登录号:NM_001289887.1)设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用SalⅠ和BamHⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600bp的特异性片段,用SalⅠ和BamHⅠ可切出大小约4 700和1 600bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加(P0.05)。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。     

基于P-M模型的棉田智能灌溉系统的设计与试验

【目的】研究并分析基于P-M模型棉田智能灌溉系统的试验设计。【方法】基于P-M模型设计一套棉田智能灌溉系统,由数据采集节点、无线通信节点、云平台决策终端、灌溉应用节点四部分组成。数据采集节点的气象设备采集到数据后无线传输至云平台决策终端,终端基于P-M模型计算单次灌溉量,在指定的灌溉时间自动发出灌溉指令,灌溉应用节点接收指令开启阀门精确灌溉,土壤墒情变化由数据采集节点的墒情设备实时监测后无线传输到云平台展现;以当地传统灌溉模式作为对照(CK),灌溉系统设置120%(W₁)、100%(W₂)和80%(W₃)3种灌溉模式,进行田间试验。【结果】3个试验组灌溉工作在无人为干预的条件下实现全智能化,系统有效精准执行灌溉指令;在灌溉水充足的情况下可选用W₂模式,总耗水量较传统模式增加16.85%的情况下土壤含盐量下降13.65%,籽棉产量提高20.84%,水分利用效率提高3.41%,能够大幅度提高产量的同时有效改善土壤环境;W₃总耗水量较传统灌溉减少6.52%,土壤含盐量上升0.16%,...     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征及其蛋白核酸酶活性分析

为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至原核表达载体p ET32a构建重组表达质粒(pET32a-5'-nucleotidase),转入大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导表达,亲和层析法纯化后采用SDS-PAGE和western blot进行分析。采用酶切活性试验分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示,鼠伤寒沙门菌SL1344株5'-nucleotidase基因为1 482 bp,5'-nucleotidase核苷酸序列与其它22种微生物的5'-nucleotidase及其类似物的同源性较低,最高仅为52.8%。理论上蛋白的分子量为57.18 ku,编码523个氨基酸。SDS-PAGE和western blot结果显示5'-nucleotidase重组蛋白约72 ku,且以可溶性和包涵体两种形式表达。同时,酶切活性试验结果显示重组5'-nucleotidase蛋白具有降解DNA的能力。本实验克隆了鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因,并表达得到了具有核酸酶活性的重组蛋白,为进一步研究5'-nucleotidase基因在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。     

获得性遗传的表观遗传学机制

随着表观遗传学的兴起,获得性遗传研究开始复兴,现已发现大量获得性遗传现象,但获得性遗传作为一种进化机制仍没有得到广泛认同,其原因在于获得性（表型）遗传如何固化为基因型的研究没有取得进展.通过综合分析表观遗传学所揭示的获得性遗传事实,提出一种获得性遗传的表观遗传学机制,给出获得性（表型）转化为基因型的可能路径.     

表观遗传的优势

表观遗传修饰主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰,它具有不改变DNA序列而能够导致遗传变化的特点,为生物应对环境快速变化和外力胁迫提供了一种应变机制,具有明显的遗传学优势。     

金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性研究

为研究金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,本研究复苏培养金黄色葡萄球菌后取培养上清液,采用透析得到金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白,结果显示获得的该蛋白浓度为48.5μg/mL。采用琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法检测金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,利用琼脂糖凝胶电泳法探究温度、pH、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白表现出降解λDNA的核酸酶活性,且最适温度和pH值分别为50℃和9.0,在低温和酸性条件下核酸酶的活性较弱,但胞外核酸酶对70℃以上的耐受性较差。不同浓度的Ba^2+、Mg^2+和Zn^2+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无影响;低浓度(0.01 mmol/L^1 mmol/L)的Ca^2+、Ni^2+、Cu^2+和Mn^4+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性;高浓度的Na^+、K^+和Fe^3+可以提高胞外核酸酶切割λDNA的活性;添加Co^2+(0.01 mmol/L^10 mmol/L)可以促进胞外分泌蛋白的核酸酶活性。本研究证实了金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,为进一步研究胞外分泌蛋白在金黄色葡萄球菌和宿主互作中的确切作用奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌cpxR和tolC双基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索CpxAR和AcrAB-tolC的协同作用对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,利用噬菌体转导技术,以前期构建的鼠伤寒沙门菌(JS)的tolC缺失株JSΔtolC::kan为供体菌,以cpxR缺失株JSΔcpxR为受体菌,在P22噬菌体的作用下成功构建了JS的双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan;再利用pCP20质粒消除卡那抗性基因kan,获得了JSΔcpxRΔtolC,并构建了cpxR回补株JSΔcpxRΔtolC/pcpxR.采用微量肉汤稀释法测定了12种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC).结果显示:tolC缺失株对环丙沙星、头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、恩诺沙星、阿米卡星的MIC值分别降低至JS的1/8、1/2、1/4、1/8、1/8、1/2、1/16、1/4、1/4、1/8、1/2;cpxR和tolC双基因缺失株对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的MIC均又进一步降低至tolC缺失株的1/2;而将cpxR基因回补到双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC中后,对环丙沙星、头孢噻肟、头孢噻呋的MIC值均升高了2倍,对恩诺沙星的MIC升高至4倍,对头孢喹肟的MIC升高了8倍.说明cpxR缺失与tolC缺失的协同作用能增强鼠伤寒沙门菌对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的敏感性.     

一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析

本研究旨在对肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）鞭毛蛋白FliC基因进行克隆，并对所获序列进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中肠炎沙门氏菌FliC基因序列设计1对引物，利用PCR克隆获得FliC基因，将其插入到克隆载体中进行测序，应用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列，利用BLAST进行同源性比对，并构建系统进化树，同时对该基因编码蛋白的理化性质、亲水性、信号肽、跨膜结构域、糖基化位点和B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行分析。结果显示，试验成功克隆了1 518 bp的目的基因，编码505个氨基酸。同源性比对发现，FliC基因相对保守，与大肠杆菌属有较高的同源性。该蛋白的化学分子式为C₂₂₅₄H₃₇₀₁N₆₅₇O₈₀₃S₄，理论分子质量为52.981 ku，理论等电点为4.91；不稳定指数为16.86，是稳定存在的亲水蛋白质。结构分析结果显示，该蛋白没有信号肽或跨膜结构域，但具有8个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和60个磷酸化位点，同时还含有26个B细胞线性结合位点和5个T细胞结合位点。二级结构分析显示，α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲分别占43.76%、3.76%、20.99%和31.49%。本试验成功克隆了肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC，并对其序列结构进行了分析，为进一步研究鞭毛在肠炎沙门致病过程中的作用及基因工程疫苗的研制提供理论依据。     

外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成的影响

以糙皮侧耳新831为材料,分别在含有不同浓度cAMP的SA培养基上培养菌丝,观察菌丝的生长发育情况。结果:与对照组相比,低浓度cAMP(0.5~3 mmol/L)对平菇菌丝生长有促进作用,随着添加浓度的升高,菌丝生长受到抑制;当添加浓度为cAMP 1 mmol/L时,菌丝蛋白含量最低且糙皮侧耳原基形成所需时间明显少于对照组;试验表明外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成存在一定的影响。研究结果为进一步解析原基形成过程中cAMP的作用机制奠定了一定的基础。