Ⅱ型圆环病毒山东泰安株的分离鉴定及系统进化分析

采用双抗体夹心ELISA方法和PCR技术对来自山东泰安的病猪组织病料进行猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)检测。将检测为阳性的病料悬液接种无PCV1污染的PK-15细胞进行病毒分离,获得一株PCV2,命名为猪Ⅱ型圆环病毒山东泰安株(PCV2 sdt)。间接免疫荧光试验(IFA)检测可见接种病毒细胞中散在特异性荧光。提取全基因组为模板,进行病毒基因组1号开放阅读框(ORF1)、2号开放阅读框(ORF2)和全基因组序列扩增,得到长度分别约为999bp、749bp和1767bp左右的产物条带。将产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-ORF1、pMD18-T-ORF2和pMD18-T-PCV2。测序结果显示,所分离病毒的ORF1、ORF2和全基因组序列长度分别为945bp、702bp和1767bp。DNAStar生物学软件分析发现,PCV2分离毒株与参考株的全基因组同源性介于95.4%~98.8%之间,ORF1的同源性介于97.0%~98.8%,ORF2的同源性略低,介于91.9%~98.4%之间。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

2株兔出血症病毒全基因测定与遗传进化分析

对2株兔出血症病毒(RHDV)SCH04、Sch07进行全基因组序列测定,并进行同源性及遗传进化分析。按照病毒核酸组成,将病毒基因分7段进行RT-PCR扩增,将分段扩增产物分别克隆到p MD-19T载体进行测序,用DNAStar进行拼接,得到全基因组序列;参照Gen Bank上登陆的31株RHDV毒株全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列以及ORF2编码基因核苷酸序列对2株病毒进行同源性和遗传进化分析。结果显示,SCH04基因组全长7 439 bp,Sch07基因组全长7 438 bp,2株病毒全基因的核苷酸序列同源性为99.8%,与31株参考毒株全基因的核苷酸序列同源性为78.3%~97.0%;2株病毒的VP60基因核苷酸序列同源性为99.7%,ORF2编码基因核苷酸序列同源性为99.2%。进化树显示2株病毒同属于抗原变异株RHDVa(GI.1a)基因群,且亲缘关系最近。VP60基因核苷酸序列与ORF2编码基因核苷酸序列均可以作为RHDV遗传进化分析。     

猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因组及ORF2的克隆与结构分析

参考GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)基因的全序列,利用反向PCR技术设计一对特异引物,用PCR方法扩增从本室分离的猪圆环病毒2型GX-FSH株全基因,另设一对引物扩增编码ORF2完整基因,将它们分别连接到pMD 18-T载体,筛选获得重组阳性质粒并对其测序分析。结果表明,所克隆的GX-FSH株全基因序列与Gen-Bank上已发表的部分PCV2毒株全基因序列同源性在94.6%~99.4%之间;相应ORF2开放阅读框的核苷酸同源性在90.0%~99.1%之间,氨基酸序列同源性为90.1%~98.7%;利用生物学软件对ORF2蛋白质结构特征分析,结果提示其成熟蛋白二级结构为β类结构。     

猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)的核苷酸序列,设计了一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出一株PCV2全基因组,将其克隆到pMD simple18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T- PCV2.对此重组质粒进行序列测定及同源性分析,结果表明,该PCV2新疆株的全基因组大小为1 767 bp,与其它PCV2核苷酸序列同源性为95.0％～99.6％,而与PCV1的同源性仅为76.8％～76.9％.     

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。     

疑似PMWS患猪中PCV2的分离及全基因组序列分析

将疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪肺脏研磨、过滤除菌后接种无PCV1污染的PK15细胞,盲传4代,用PCR和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测。同时,利用所合成的PCV2全长的特异性引物进行病毒基因组全长的扩增及克隆、测序与比对分析。结果显示,不同传代细胞中PCV2核酸均为阳性,且PCV1特异引物检测为阴性,表明分离到的PCV2无PCV1污染,将该毒株命名为PCV2 B1株。序列分析表明,该病毒基因组全长1767 bp,与其他毒株的核苷酸同源性在95.4%~99.8%之间,ORF1的氨基酸的同源性在98.4%~99.7%之间,ORF2的氨基酸的同源性在89.7%~100%,核苷酸和氨基酸的序列与保定株BD1A(DQ910865)的序列最接近。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

7株猪圆环病毒2型福建分离株全基因组序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,分段设计2对PCV2特异性引物,用PCR方法扩增近年从福建省部分发病猪场分离鉴定的7株PCV2的全基因序列并进行比对分析.结果表明:7株PCV2基因组全长1767 bp,与GenBank上发表的17株PCV2参考毒株的同源性为94.7%-99.5%;7株PCV2分离株之间的全基因同源性高达98.4%-99.5%;7株PCV2 ORF2编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性,其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达98.9%-99.7%和97.9%-99.6%,与参考毒株的同源性分别为91.1%-99.7%和85%-100%,存在一定的差异.可见,7株PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异.     

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析

为了解禽呼肠孤病毒（ARV）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV（R1、R2）分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株ORF3基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因序列,设计合成了1对特异性引物,扩增出病毒ORF3结构基因。将该基因克隆到pMD18-T,构建了重组质粒pMD18-ORF3,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的ORF3基因组全长812 bp。通过DNAman对所测ORF3基因核苷酸序列与GenBank中登录的国内外PRRSV毒株核苷酸序列进行同源性比较。序列分析结果显示,XJPRRSV1/03与参考毒株VR2332、LV、CH-1a的核苷酸同源性分别为95.8%,89.8%,92.7%,氨基酸同源性分别为96.6%,88.5%,93.2%。XJPRRSV1/03与VR2332同源性最高。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

参照Genbank上公开发表的PCV1全基因序列设计引物,以质粒pSK-PCV为模板扩增出PCV1-ORF2基因,插入pMD18-T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1基因序列相比较,同源性达97％,再与Genbank上发表的PCV2的ORF2基因序列相比较发现PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1-ORF2的氨基酸序列同PCV2-ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因的克隆与原核表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2) ORF1基因序列,设计合成了一对引物,扩增出PCV2新疆株ORF1基因片段.将扩增出的ORF1基因(945 bp)插入到pMD18-T载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD18-ORF1.将ORFI酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒,命名为pET-...