RNA干扰对大鲵蛙病毒主要功能基因表达及其增殖的影响

采用q PCR与病毒滴度测定观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)、甲基转移酶(methyltransferases,MTases)、DNA多聚酶(DNA polymerase)基因表达与病毒增殖的影响。结果表明,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能推迟鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini,EPC)出现病变,且病变程度也较对照组轻。在各功能基因表达量上,NC-FAM对照组与阴性对照组差异不显著(P0.05);而干扰组的干扰率极显著高于阴性对照组,其中siR-DP-1组siRNA对MCP基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01);siR-MT-1、siR-MT-2组siRNA对MTases基因的干扰率为77%,极显著高于其余组(P0.01);siR-DP-1组siRNA对DNA polymerase基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01)。干扰实验组病毒滴度与NC-FAM对照组和阴性对照组相比也有不同程度的降低。阴性对照组lg TCID50为8.362,NC-FAM对照组lg TCID50为7.848,siR-MCP、siR-MT、siR-DP实验组最低lg TCID50分别为5.764、5.317、5.362。证实RNAi能够抑制CGSRV主要功能基因的表达并影响病毒的复制。     

拟态弧菌感染黄颡鱼的动态病理损伤及病原分布研究

以1.0×106CFU·m L~(-1)拟态弧菌(Vibrio mimicus)浸浴感染黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco),于第0、第4、第8、第16、第24、第36、第48、第60、第72小时剖杀取样,研究病理损伤及病原菌的体内动态分布。结果显示,皮肤肌肉、鳃、肠道出现病变最早,其中皮肤肌肉损伤最严重。第16小时表皮变性、坏死,鳃上皮肿胀,肠绒毛水肿;第24~第48小时表皮坏死、脱落,真皮严重出血,肌纤维变性、坏死,鳃出血,上皮局部坏死,肠上皮变性与灶性坏死;第48~第72小时皮肤肌肉坏死更严重,形成溃疡灶,鳃灶性坏死。肾、肝、脾与心36 h后相继出现不同程度的淤血、出血,变性和灶性坏死。q PCR检测发现,第4小时即在鳃、肠、皮肤肌肉检出病菌,细菌含量分别为1.3×102CFU·mg~(-1)、2.6×102CFU·mg~(-1)、4.7×102CFU·mg~(-1);鳃与皮肤肌肉中菌量随时间延长而增加,第72小时皮肤肌肉中菌量达到4.5×107CFU·mg~(-1);第24小时后相继在肾、肝、脾、心检出病菌,菌量介于1.9×10~4.7×102CFU·mg~(-1)之间。结果表明皮肤、鳃和肠道是病菌的入侵位点,并在体内多组织、器官分布。     

水环境中Ni~(2+)对鲤鱼鳃和肝脏的组织损伤

为研究水环境中Ni~(2+)对鲤鱼鳃和肝脏的组织损伤,将鲤鱼(Cyprinuscarpio)暴露在Ni~(2+)浓度为0、0.55、0.62、0.72、0.83、0.96、1.09、1.25mmol/L的水环境中进行急性毒性试验,并通过组织切片观察鳃和肝脏的组织病理变化。结果显示,Ni~(2+)对鲤鱼的96h半数致死浓度(LC_(50))为0.72 mmol/L,安全浓度(SC)为0.007 2 mmol/L。高浓度Ni~(2+)(1.25 mmol/L)试验组鲤鱼的鳃小片呼吸上皮细胞坏死、脱落,肝血窦淤血,肝细胞核固缩;中低浓度Ni~(2+)(0.72～1.09mmol/L)试验组鲤鱼的鳃小片呼吸上皮水肿浮离、细胞增生,血窦充血,肝细胞胞浆空泡化。表明水环境中的Ni~(2+)浓度高于0.007 2mmol/L时会对鲤鱼的鳃和肝脏造成急性毒性,导致鳃和肝脏出现明显的组织病理变化。     

长薄鳅恶臭假单胞菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是广泛分布于土壤、水体中的一种条件致病菌,可感染两栖类、鱼类和甲壳类等多种水生动物。2017年8月,四川省西昌市某养殖场的长薄鳅出现一种以体表溃烂、鳍条出血为主要特征的传染病。为探究其病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌表型特征测定、16S rRNA与gyrB基因序列分析。从病鱼肝、脾、肾中分离到优势菌株(BMH170820),人工感染试验证实了其病原性。根据其菌落形态、生理生化特性,结合16S rRNA与gyrB基因序列分析鉴定其为恶臭假单胞菌。组织病理学观察发现,其感染长薄鳅对鳃、肾、肝、心、脾与消化道等多处组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,致全身多器官功能障碍而死亡。药物敏感试验显示,该菌对新霉素、氧氟沙星以及强力霉素等敏感,而对阿莫西林、头孢氨苄与氟苯尼考等耐药。     

棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2016年4月四川雅安一棘胸蛙(Quasipaa spinosa)养殖场暴发一种临床特征表现为白内障、体表溃疡和神经症状的传染病。为明确此次流行病病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌理化特性与16S rDNA基因序列分析。结果从患病蛙肝、脾、肾中分离到一株G^-短杆菌(CM160701);将其腹腔注射感染健康棘胸蛙表现出与自然发病蛙相似症状。该菌的LD₅₀为1.19×10⁶ cfu·只^-1;通过理化特性与16S rDNA基因序列分析鉴定分离菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica);其对氟苯尼考敏感,对恩诺沙星、多西环素、阿莫西林等多种药物耐受。病理组织学观察发现,其感染对全身多组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,尤以脑、肝、脾、心和肾损伤严重。该研究证实了脑膜炎败血伊丽莎白菌是本次疫情的病因,其感染引起棘胸蛙全身性损伤导致多组织器官功能障碍而死亡。     

温度对锦鲤疱疹病毒体外培养和致病性的影响

【目的】证实温度对锦鲤疱疹病毒CyHV-3体外增殖和致病性的影响。【方法】选用CyHV-3-EGFP病毒株为研究对象,采用间接免疫荧光染色法测定病毒滴度,使用荧光显微镜观察病毒体外增殖,研究病毒的热稳定性、以及温度对病毒的体外培养和体内致病性的影响。【结果】CyHV-3在4~36℃条件下具有很好的稳定性,温度超过36℃后,病毒活力随着温度升高而降低,50℃时病毒活力完全丧失。感染温度对CyHV-3病毒活力影响不大,高温(37℃)和低温(4℃)时病毒都具有感染能力。但是,孵育温度明显影响病毒活力,温度高于30℃时,CyHV-3的增殖能力减退甚至消失。鲤鱼感染CyHV-3病毒后,低温组(15℃)的死亡率为26.67%,常温组(25℃)的死亡率为73.33%,高温组(30℃)和对照组的死亡率均为0。【结论】证实了CyHV-3病毒在低温下能够增殖并且具有致病性,解释了近年来锦鲤疱疹病毒(KHVD)的暴发及流行不再受限于春秋季节的现象。     

斑点叉尾鮰暴发性出血溃疡症的病理学研究

【目的】探究两起斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus暴发性体表出血溃疡症的发病病因和病理特征。【方法】利用湿片法对鳃组织和体表黏液进行压片,观察寄生虫寄生情况。从发病鱼的肝脏、脾脏和肾脏中分离病原菌,检测细菌感染情况;利用PCR法检测患病斑点叉尾鮰的肝、脾、肾混合组织匀浆中斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)的携带情况。运用组织病理学方法观察病鱼的病理损伤特点,综合分析并推测该病的致病原因。【结果】该出血溃疡症的靶器官主要为脾脏、肾脏、肝胰脏、肠道以及皮肤肌肉。主要表现为严重的血管反应,实质细胞可见肿胀、变性、坏死;而胃、脑和心脏病变较轻,仅有轻微的炎症;鳃丝、眼球和鳔等未见明显病变。所有的患病个体均出现中度至重度出血性坏死性脾炎、中度肾炎、轻度至中度坏死性肝胰腺炎和肠炎。患病斑点叉尾鮰体内未检测到寄生虫、细菌以及CCV。【结论】综合病理学、细菌学和病毒学检测结果,推测此次斑点叉尾鮰暴发性疾病由某种非CCV的病毒感染所致,温度应激可能是引发该病的条件诱因。     

柱状黄杆菌部分生物学特性的研究

采用革兰氏染色法、比色法和平板扩散法对柱状黄杆菌Flavobacterium columnare的部分生物学特性进行了研究。结果表明：用肉汤培养柱状黄杆菌24 h时,其形态多样,如半圆形、U型、V型或S型等;培养48 h时,柱状黄杆菌中开始出现颗粒状老龄培养物;培养72 h时,有部分菌体发生的＂分节＂现象,而老龄培养物也增多。用肉汤培养时,该菌的最佳生长条件分别是NaCl浓度为2.0 g/L,pH为7.4,温度为25～28℃。在最佳培养条件下,该菌的胞外产物具有蛋白酶、脂酶和卵磷脂酶活性,然而却检测不到淀粉酶、明胶酶和脲酶活性。     

斑点叉尾鮰 链球菌病的发生与诊治

2006年6月到9月，广西横县西津水库网箱养殖的斑点叉尾鮰暴发了一种急性传染病，在发病一周左右时间内就造成了大批斑点叉尾鮰死亡，病害波及4000多口网箱，造成经济损失上百万元。2007年6月5日，广西横县西津水库某养殖户300箱斑点叉尾鮰中10箱出现死亡，3天后波及到80个网箱，死亡率高达90%，至12日死亡达10吨以上。与此同时，同一水域其他养殖户的斑点叉尾鮰也相继发病，     

斑点叉尾 源嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗研究

采用反相蒸发法制备嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗,通过灌胃分别给予各组斑点叉尾(鮰)(Ictalurus punctatus)脂质体疫苗(Ⅰ-Ⅲ组)、嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗(Ⅳ组)和生理盐水(Ⅴ组),每2周给药1次,共3次.于接种疫苗后第1天、14天、28天和第49天采集静脉血,测定白细胞的杀菌活性和血清抗体IgM含量的变化,并用细菌攻毒实验检测免疫保护效应.结果显示,本实验制备的脂质体疫苗粒径约为(0.9±0.3)μm,包封率为53.23%,与嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗相比能显著增强斑点叉尾(鮰)吞噬细胞的杀菌活性和血清抗体:IgM水平.腹腔注射活菌攻毒后,脂质体疫苗免疫的Ⅰ-Ⅲ组的相对免疫保护率分别为34.8%、48.2%和55.4%;而嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗免疫的Ⅳ组的相对免疫保护率仅有6.7%,生理盐水对照Ⅴ组保护率则为零.研究表明,口服脂质体疫苗对斑点又尾(鮰)具有显著的免疫保护效应,可作为预防嗜麦芽寡养单胞菌感染的疫苗.