猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析（英文）

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在PK15细胞上增殖,特异性PCR检测可扩增出特异性片段,经PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%~96.8%;与AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ和AF055392属于基因型PCV2a,与PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区PCVAD的防控提供了理论依据。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

华南地区猪圆环病毒3型分子流行病学研究

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒类型,为了解PCV3在华南地区的分布及其分子流行病学,应用荧光定量PCR方法对华南地区的临床样品进行检测,然后对PCV3阳性样品进行全基因组扩增和测序,将获得的7株PCV3核酸序列与国内外参考毒株进行遗传变异分析。结果表明,华南地区送检的临床样品和猪场的PCV3阳性率分别为46.3%和69.2%,7株PCV3毒株与国内外的参考毒株同源性为97.4%~99.8%,而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为96.6%~99.8%和96.7%~99.5%。由此可见,PCV3在我国华南地区已经广泛存在。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及其全基因组序列分析

为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株。通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6%。挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析。结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2%~98.3%,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6%。系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型。     

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板，用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段，随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2 000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示，这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上，系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近，表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支，所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列，虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性，但却分属于2种基因型，并呈现出一定的地域差异。     

浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

猪圆环病毒1型北京株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。     

猪圆环病毒2型吉林株的分离鉴定及全基因序列分析

利用大体病理剖检、病理组织学观察、病原分离、PCR检测等方法对长春郊区一例猪圆环病毒病进行了病理学和病原学诊断,证实造成病猪死亡的原因为猪圆环病毒2型(porcine circovirus2,PCV2)感染所致,并将该分离毒株命名为PCV2-JL/China/2015。参照Genbank已公布的PCV2基因序列,设计合成一对用于PCV2全基因序列扩增的特异性引物,成功获得PCV2-JL/China/2015毒株的全基因序列。序列测定结果显示,PCV2-JL/China/2015毒株基因组全长为1 767 bp;遗传进化树分析结果显示,该分离株与我国湖南长沙病毒株FJ594471-1C01分离株亲缘关系较近,处于同一进化分支上。     

7株猪圆环病毒2型福建分离株全基因组序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,分段设计2对PCV2特异性引物,用PCR方法扩增近年从福建省部分发病猪场分离鉴定的7株PCV2的全基因序列并进行比对分析.结果表明:7株PCV2基因组全长1767 bp,与GenBank上发表的17株PCV2参考毒株的同源性为94.7%-99.5%;7株PCV2分离株之间的全基因同源性高达98.4%-99.5%;7株PCV2 ORF2编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性,其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达98.9%-99.7%和97.9%-99.6%,与参考毒株的同源性分别为91.1%-99.7%和85%-100%,存在一定的差异.可见,7株PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异.     

疑似PMWS患猪中PCV2的分离及全基因组序列分析

将疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪肺脏研磨、过滤除菌后接种无PCV1污染的PK15细胞,盲传4代,用PCR和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测。同时,利用所合成的PCV2全长的特异性引物进行病毒基因组全长的扩增及克隆、测序与比对分析。结果显示,不同传代细胞中PCV2核酸均为阳性,且PCV1特异引物检测为阴性,表明分离到的PCV2无PCV1污染,将该毒株命名为PCV2 B1株。序列分析表明,该病毒基因组全长1767 bp,与其他毒株的核苷酸同源性在95.4%~99.8%之间,ORF1的氨基酸的同源性在98.4%~99.7%之间,ORF2的氨基酸的同源性在89.7%~100%,核苷酸和氨基酸的序列与保定株BD1A(DQ910865)的序列最接近。     

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

猪流行性腹泻病毒G2a变异株CH-HK-2021的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】明确猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞（Vero）上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验（IFA）、 Western blotting、 RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID50测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株; IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为105.6 TCID₅₀/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly （A）尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01（KX058031）的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。     

猪圆环病毒Ⅱ型DT株的分离鉴定及动物模型建立

应用PCR方法对江苏省东台市某猪场送检的一头无名高热病死猪的腹股沟淋巴结及肺脏病料进行检测.结果表明:该病料中存在PCV2;病料转染PK-15细胞,盲传3代后,IFA方法检测结果显示有明显的特异性荧光.利用设计的一对特异性引物对PCV2-DT株(东台分离株)全长基因进行扩增,测序结果显示所扩增基因为PCV2全长基因,大小为1 767 bp,包括11个完整的开放阅读框(ORF).PCV2-DT分离株与其他20株PCV2分离株序列比较发现,核苷酸同源性都在95%以上,并与欧美株处于同一分支.PCV2-DTRep、Cap序列同国内分离的16株相比较,核苷酸序列同源性分别为97.5%~100%和94.2%~99.9%.氨基酸序列同源性分别为98.4%~99.7%和93.2%~99.6%.用PK-15细胞从病料中分离的细胞毒接种3头42日龄健康仔猪(血清学检测无PCV1、PPV、PRV等感染),于首次接毒后的第10天出现发热、咳嗽、水样腹泻等症状,食欲几乎废绝,出现了PM-WS症状,初步建立了PMWS动物模型.     

浙江部分地区猪瘟流行现状的调查与分析

为了解当前浙江省猪瘟流行情况,对浙江省8个地市的18个疑似猪瘟发病场的流行病学资料进行调查与分析。结果表明,浙江省猪瘟以非典型为主,典型猪瘟也同时存在,绝大多数都是在外界诱因（如长途运输、去势、注苗）诱导或其他病原感染下发生,多为3月龄以内仔猪发病且病程较长。母猪存在隐性感染,部分表现为繁殖障碍,一些临床健康猪存在带毒问题。此外,从疑似猪瘟的38份病料中检出猪瘟病毒（CSFV）、猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCVⅡ）,检出率分别为47.37%,44.7%和23.68%;而PRRSV、PCVⅡ分别与CSFV的混合感染率为33.3%和11.1%。分子流行病学调查结果表明,浙江猪瘟流行株与CSFV石门毒株（Shimen株）和CSFV兔化弱毒株（HCLV株）2个传统毒株的E2核苷酸同源性分别为81.2%～83.0%和83.1%～84.0%,与不同厂家的弱毒疫苗株核苷酸同源性为81.7%～82.6%,说明浙江省猪瘟流行株正朝远离疫苗毒发展并呈现遗传多样性。     

生物絮凝剂生产菌的分离与鉴定及其絮凝特性分析(摘要)(英文)

[目的]对分离自土壤样品中的一株微生物絮凝剂产生菌W5进行系统鉴定并分析其絮凝特性。[方法]以细菌的16SrDNA通用引物对其基因组进行PCR扩增,并采用单因素法分析培养基的pH值、碳源和氮源对絮凝活性的影响,采用红外光谱法进行功能基团的分析。[结果]同源性比对结果表明菌株W5与Hymenobacter gelipurpurascens具有98.34%的同源性,为革兰氏阴性,长杆菌。菌株W5生长发酵培养基最佳条件为pH值7.04、葡萄糖为碳源、酵母粉为氮源。对菌株W5所产的微生物絮凝剂(MBF-W5)进行提取纯化,所得产物微红色絮状物。红外分析结果表明,MBF-W5中主要的功能基团为羟基、羧基和氨基。[结论]在絮凝剂用量为150～500μl,温度为5～65℃,pH值为2～10的范围内均具有85%以上的絮凝活性。     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。     

猪Ⅱ型圆环病毒浙江分离株全基因组的克隆与序列分析

越来越多的证据显示,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原之一.本研究克隆了两株PCV2浙江分离株(JS2003和Zhuji2003)的全基因并对其进行测序.序列分析结果表明,这两个基因组全长均为1767nt,与GenBank中的其它24株PCV2相比,核苷酸同源性为94.8%～99.8%,而与4株PCV1的核苷酸同源性仅为76.5%～78.0%.虽然PCV2基因从总体上来说相对稳定,但在不同地区分离到的PCV2中确实存在一定的基因差异.