猪流行性腹泻病毒G2a变异株CH-HK-2021的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】明确猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞（Vero）上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验（IFA）、 Western blotting、 RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID50测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株; IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为105.6 TCID₅₀/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly （A）尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01（KX058031）的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。     

一株鼠李糖乳杆菌的培养条件优化研究

为了探索鼠李糖乳杆菌的生长特性和最适培养条件,研究采用单因素试验设计,分别考察了温度、培养基初始p H值、供氧水平和培养周期等参数对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)菌体生长的影响。结果表明鼠李糖乳杆菌的最适生长温度为39℃、最适p H为6.0,适宜在低溶氧量的环境中培养。研究证实鼠李糖乳杆菌适宜在偏酸性的厌氧环境中生长,在39℃下培养6 h活菌量可达108.5cfu/m L,上述结果对于鼠李糖乳杆菌的规模化生产具有一定的指导意义。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为了解中国猪群中猪诺如病毒感染情况,本研究根据猪诺如病毒保守的RNA依赖性RNA多聚酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RDRP)基因序列设计了一套巢式RT-PCR引物,用该引物从猪粪便样品中扩增出与预期目的产物大小一致的条带,经克隆、测序后获得的序列与GenB ank数据库序列比对,证明所扩增的序列属于猪诺如病毒,表明本研究成功建立了猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法。该检测方法具有高特异性和敏感性,应用该方法检测某猪场健康育肥猪粪便样品,阳性率为54.5%。通过RDRP基因进行核苷酸同源比对发现本文获得的猪诺如病毒Wuning 1株属于GII群诺如病毒,与美国猪诺如病毒毒株OH-QW101/03/US、中国猪诺如病毒毒株Norovirus pig/GII/Ch6/China/2009核苷酸序列同源性最近。值得注意的是猪诺如病毒Wuning1毒株与武汉人诺如病毒毒株E2120/CHN/2010核苷酸同源性高达77.1%,说明猪诺如病毒Wuning 1毒株与武汉人诺如病毒基因组上亲缘性较近。本研究成功建立了一种检测猪诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并应用于临床猪粪便样品的检测,为猪诺如病毒的诊断与监测提供了可供借鉴的方法、为猪诺如病毒的进化、分子病毒学及与人诺如病毒关系的深入研究提供依据。     

大豆球蛋白提取条件优化及7S和11 S亚基的鉴定

大豆球蛋白是豆粕饲料的主要营养成分之一,对豆粕饲料的营养品质有着重要影响,其中7S伴大豆球蛋白及11S球蛋白是大豆球蛋白最重要的成分。研究分析了在不同提取液,不同的pH,不同的温度,不同浓度的Tris-HCl提取液及不同料液比对豆粕大豆球蛋白提取的影响,并且对7S伴大豆球蛋白和11S球蛋白进行了分析。最终SDS-PAGE结果显示55℃、0．05 mol/L、pH9．0的Tris-HCl溶液在料液比为1∶10时能够提取较多的球蛋白,并且7S伴大豆球蛋白由3个亚基组成,其相对分子量分别为60466 Da,55029 Da和49043 Da,11S球蛋白也由3个亚基组成,其相对分子量分别为44634 Da,39779 Da和17952 Da。