新疆部分地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的分离鉴定

[目的]了解新疆地区BVDV毒株的生物型和基因型.[方法]采集新疆石河子和伊犁地区疑似感染病毒性腹泻-黏膜病病毒牛的新鲜粪便174份,应用RT-PCR方法对其进行检测,将检测结果为阳性的样品接种于MDBK细胞上培养,电镜观察,测定毒价,使用RT-PCR方法对细胞培养物进行鉴定,并提取质粒进行测序,对结果分析.[结果]该毒株可使MDBK细胞发生病变,扩增出一条286 bp目的片段,经同源性和遗传进化分析,确定为BVDV-1型毒株.[结论]分离到一株BVDV-1型新疆毒株,可使MDBK细胞发生病变,病毒粒子直径约为20～ 40 nm,毒株TCID50 10-4.5/0.1 mL.     

梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定

从吉林省某鹿场梅花鹿流产胎儿肝脏病料中分离出1株病毒,并对其进行了鉴定。结果表明：该毒株接种于佃BK传代细胞后出现了BVDV典型而规律的细胞病变,其理化特性与BVDV相同,致细胞病变作用可被BVDV国际标准株C24V株的牛阳性血清所阻断,电镜负染观察病料接种MDBK细胞的F1代浓缩病毒液,可见典型的BVDV粒子形态,从F1代浓缩病毒液中分别扩增出402bp(NS2-3)和700bp(R)的目的片段。认为该毒株是BVDV,命名为CCSYD株。     

江浙部分地区牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查及BVDV-2型毒株分离鉴定

为了解江浙地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的流行情况,于2016～2017年在江浙部分地区采集了145份临床腹泻犊奶牛血清样品,并对其进行RT-PCR检测,对阳性样品的5′-UTR和N~(pro)基因进行序列与遗传进化树分析。145份血清样品中共有19份样品为BVDV阳性,阳性率为13.1%,其中江苏和浙江地区的阳性率分别为14.1%和11.9%。根据阳性样品的5′-UTR和N~(pro)基因序列进行遗传进化树分析,18份样品为BVDV-1型,包括1a(n=2)、1b(n=6)、1c(n=2)、1m (n=7)和1q(n=1)亚型;1份样品为BVDV-2型,其5′-UTR和N~(pro)基因序列分析均显示与我国吉林分离株BVDV-2SD1301同源性最高,分别为99.0%与97.0%。同时,对BVDV-2型阳性样品进行病毒分离、RTPCR检测和IFA鉴定,证实成功分离到1株非致细胞病变型(ncp)BVDV-2病毒,命名为BVDV-2JZ21。结果表明:江浙部分地区存在较高比例的BVDV感染,且基因型多样,其中BVDV-1b与1m亚型为该地区感染的主要亚型,分别占33.3%和38.9%。此外,该地区已存在BVDV-2感染。这一研究丰富了BVDV的分子流行病学数据,也为BVDV疫苗研制提供了一定的理论基础。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

基于密码子偏性对应分析数据的牛病毒性腹泻病毒分型研究

【目的】牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分型对于阐明病毒的致病机理、分析其流行规律以及其进化意义重大,本文旨在探索一种基于密码子使用偏性的BVDV分型鉴定方法.【方法】应用CodonW计算102株不同BVDV病毒株基因组序列的相对同义密码子使用度(RSCU)等相关参数,并用Excel和STATISTICA软件对其中的对应分析数据进行统计分析,对BVDV毒株在密码子使用偏性方面的差异进行聚类,将结果与基于BVDV RNA聚合酶基因和5′非翻译区序列的分子进化树进行比较.【结果】分析表明,BVDV的对应分析数据分布相对集中于不同象限中,具有型特异性;密码子偏性表现高度的型内相似性,BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3分别聚集成一类,与分子进化树分析结果一致.【结论】结果提示,基于密码子使用偏性对应分析数据的聚类分析可以应用于BVDV的分型研究.     

牛病毒性腹泻病毒地方株的分离与鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻 (BVD)疑似病例中采集病料 ,将处理好的 6份病料接种MDBK细胞 ,并盲传 4代 ,得到了 2株可产生细胞病变的病毒。 2株病毒的TCID50 分别为 10 - 5.59和 10 - 5.51;琼脂扩散试验表明 ,2株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)OregonC2 4 标准阳性血清反应 ,出现沉淀线 ;中和试验表明 ,2株病毒均能被BVDV标准阳性血清中和 ,中和指数分别为 10 3.30 和 10 3.16 ;电镜观察到圆形 ,直径为 4 0～ 6 0nm ,有囊膜 ,囊膜表面有突起的病毒粒子 ,与BVDV颗粒基本一致。因此 ,确定分离的 2株病毒均为BVDV ,分别将其命名为HN - 1株和HN - 2株。     

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS5b基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。     

新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定及分子流行病学调查

【目的】了解新疆地区牛病毒性腹泻(BVD)的流行状况,【方法】采用RT-PCR方法对从新疆16个不同地区采集的样品进行BVD病毒5'-UTR扩增,对扩增出的序列进行测序,构建系统遗传进化树和遗传变异分析。【结果】566份样品中,扩增出21份阳性样品,平均阳性率为3.71℅。通过对分离株序列的同源性比对分析,17株为BVDVI型,4株为BVDVⅡ型。经对PCR扩增阳性样品进行细胞传代,有7株为致细胞病变型(CP),14株为非致细胞病变型(NCP)毒株,所测得的病毒滴度为1.04×103~6.02×108TCID50/0.1 m L,21株分离病毒对BVDV阳性血清的中和效价为1:21~1:25。【结论】BVD在新疆地区均不同程度的发生和流行。研究的成果,为BVD的有效防控提供了技术资料。     

奶牛卵巢中一株IBRV的分离鉴定

利用MDBK细胞从奶牛卵巢中分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)毒株。设计扩增IBRV的通用引物,对卵巢组织中的病毒进行PCR扩增及测序;对卵巢组织感染MDBK细胞,进行IBRV的分离培养;测定IBRV的TCID_(50),同时利用IBRV FA进行鉴定。结果表明,分离到的病毒在MDBK细胞上产生了明显的病变;用特异性引物可扩增出特异性目的条带,目的序列与IBRV基因序列一致;该毒株的病毒滴度为10~(6.75) TCID_(50)/mL。     

牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

[目的]为了解牛病毒性腹泻/黏膜病在新疆的流行现状,对疑似该病病料进行地方毒株的分离,并对其进行鉴定.[方法]将采自新疆不同地区疑似牛病毒性腹泻的病料接种MDBK细胞,并盲传2～4代;对分离株进行毒力测定及中和试验,应用RT-PCR方法扩增分离株的5'UTR基因片段并克隆测序分析.[结果]分离到的8 株病毒可发生细胞病变,在MDBK细胞上的TCID50为103～106.毒株血清中和实验结果,RT-PCR反应结果,克隆后重组质粒经BamH I、Hind III双酶切鉴定、重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段.重组质粒测序结果与GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒NADL株序列同源性为82.0;～94.8;.[结论]证实所分离到的病毒为BVDV,命名为B-S-1、B-S-2、B-S-3、B-S-4、B-S-5、B-S-6、B-G-1和B-G-2.     

一株牦牛源牛病毒性腹泻病毒毒株的分离鉴定及其遗传特性分析

通过病毒分离培养技术,从牦牛血清中分离获得一株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为GSTZ毒株。经电镜观察,GSTZ毒株的直径在50~60 nm。按Karber法测算,该病毒滴度为5.0×10^6.5 mL^-1[以组织半数感染量(TCID₅₀)计]。利用反转录PCR(RT-PCR)测定GSTZ毒株的完整开放阅读框(ORF),全长11 691 nt,将其与参考毒株ORF在核酸序列和同义密码子使用模式等方面进行分析,确定GSTZ毒株在遗传学特性上属于基因1型家族成员。在GSTZ毒株的完整ORF中,A+U的出现频率要高于G+C,而且,病毒同义密码子的使用模式体现出对U/A结尾同义密码子使用偏嗜性高的遗传学特征。GSTZ毒株明显降低了使用含有CpG二联核苷酸的同义密码子的频率。这有助于降低病毒对宿主细胞免疫系统的刺激强度,从而促进病毒的复制增殖。研究成果可为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料,并为BVDV不同基因型的抗原关系分析与BVDV疫苗的研制奠定基础。     

猪乙脑病毒BHK-21细胞传代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因组序列分析

为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致,均为10 977 nt,在2个病毒基因组的10 701 nt位点处均插入1个碱基G。与亲本毒株相比,2个细胞传代毒株的病毒基因组经连续传代后趋于稳定,均有10个位点发生氨基酸突变,这些突变主要集中在E蛋白区域。核苷酸序列同源性比对分析发现,与其他JEV参考毒株相比,BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60与弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性较高,分别为99.6%和95.9%,其氨基酸序列与猪源野毒分离株SH0601和HW的氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。     

西部散养肉牛病毒性腹泻病毒流行及遗传变异

【目的】牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）是一种可导致养牛业出现重大经济损失的常见病原体。该文以中国西部散养肉牛为研究对象,拟通过血清学方法和生物信息分析,评估BVDV在中国散养肉牛中的整体流行状况,探究国内流行的BVDV基因多样性,为制定针对BVDV的合理防控措施和疫苗的研发提供理论依据与素材。【方法】2014-2015年分别从云南、新疆、甘肃和内蒙古4省（区）采集散养肉牛的血清样本共1 332份,利用BVDV抗体检测试剂盒进行检测,统计不同地区散养肉牛BVDV抗体阳性率。将抗体阴性的血清样本进行BVDV抗原检测,抗原阳性或可疑血清接种MDBK细胞,连续盲传五代分离病毒。根据BVDV 5'-UTR保守序列设计引物,经RT-PCR扩增5'-UTR序列并测序。利用Sequencher4.2、BLAST、ClustalX、MEGA5.2等软件对序列进行生物信息学分析,绘制流行毒株系统进化树,确定分离毒株的基因型。【结果】4省（区）散养肉牛BVDV整体抗体阳性率为33.93%。血清抗体阳性率从高到低依次为内蒙71.43%,新疆57.69%,甘肃第16.54%,云南10.0%。BVDV抗原整体阳性率为1.58%,新疆抗原阳性率最高。研究共分离13株BVDV流行毒株,分别命名为甘肃120、内蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇台13041、新疆奇台13042、新疆奇台13191、新疆奇台13220、新疆奇台13251。进化树分析显示新疆地区散养肉牛中流行的主要是BVDV-1q和BVDV-1f,内蒙地区流行的主要是BVDV-1m,甘肃地区流行的是一种新的基因亚型BVDV-1u。【结论】通过血清学方法检测发现,虽然4个省（市、自治区）散养肉牛整体抗体阳性率低于国内平均水平,但情况却不尽相同。内蒙古和新疆抗体高阳性率表明BVDV在这些地区散养肉牛中已经广泛流行,必须采取适当措施将其危害性降到最低。从基于5'-UTR序列绘制的系统进化树可以看出,不同地区散养肉牛感染的BVDV基因亚型有所不同。总体看来,BVDV在散养肉牛中的分布呈现多样性,跨物种、跨地域传播和高突变性等特点,这些都使疫苗免疫策略面临严峻的挑战。研究通过对各地区散养肉牛的随机大量采样、检测和分析,客观评价BVDV在散养肉牛中的流行情况,为更好的制定预防策略提供参考依据。     

一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。     

猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)SA毒株的分离与鉴定

从仔猪内脏分离到一株猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株，该毒株能在Marc－145细胞上增殖致细胞病变，该病变能被PRRSV美洲型阳性血清所抑制，不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制，经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察到直径55nm左右的病毒粒子，属RNA病毒，接种阴性仔猪未见临床症状异常，但血清学阳性。命名该分离毒为PRRSV－SA毒株。     

牛传染性鼻气管炎的分离鉴定和灭活条件的优化

从疑似牛传染性鼻气管炎病毒感染的牛鼻腔中分离出1株病毒,通过PCR方法和MDBK细胞病变观察对其进行鉴定,确定该分离株为牛传染性鼻气管炎毒株。通过对该毒株的增殖条件和甲醛灭活条件的优化研究,为制备牛传染性鼻气管炎细胞源灭活疫苗提供参考依据。结果表明该毒株接毒18h后病变细胞达70％开始收毒,病毒液在0．2％的甲醛37℃灭活36h灭活效果最好。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定及gD基因序列分析

[目的]从疑似牛传染性鼻气管炎病毒感染的牛鼻腔棉拭子中分离出1株病毒,对其进行鉴定和序列分析。[方法]从疑似牛传染性鼻气管炎病毒感染的牛鼻腔棉拭子中分离到1株病毒,将其命名为NM株。通过PCR、MDBK细胞病变观察、中和试验、动物回归试验、gD基因序列分析对其进行鉴定。[结果]确定该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒强毒株。NM株病毒能使MDBK细胞产生牛传染性鼻气管炎病毒典型性细胞病变。Reed-Muench法测定NM株病毒的TCID50为10-6.0/ml。NM株病毒与IBRV阳性血清发生中和反应,而与IBRV阴性血清不发生中和反应。NM株病毒能使8月龄IBRV抗体阴性牛致病,表现出牛传染性鼻气管炎的典型临床症状。gD基因序列鉴定结果表明NM株病毒与IBRV K22株的同源性最高。[结论]该研究可为IBR诊断试剂与疫苗的研制奠定基础。     

羊口疮病毒ORFV/GD-QY/01 株的分离鉴定

利用MDBK细胞对广东清远某羊场的痂皮病例进行病毒分离,获得一株ORFV,命名为ORFV/GD-QY/01。参考NCBI羊口疮病毒(Orf virus)保守基因B2L序列,设计一对特异性引物进行PCR扩增后测序;运用序列分析软件对获得的羊口疮病毒株B2L基因核苷酸序列与其他羊口疮毒株进行多序列比对,构建系统发育进化树。结果表明:接种病料悬液的MDBK细胞出现细胞病变,扩增出ORFV B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106、DQ904351)相似性最高(均为99.2%),亲缘关系最近。     

牛传染性鼻气管炎病毒XA株的分离与鉴定

【目的】利用MDBK细胞进行牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)XA株的分离与鉴定。【方法】用MD-BK细胞从陕西发病奶牛鼻拭子中分离IBRV;使用IBR标准阳性血清对该病毒分离物进行中和试验;根据GenBank公布的IBRV基因组序列,利用gB保守序列设计1对引物,对分离病毒进行PCR扩增并测序。【结果】分离病毒在MDBK细胞上产生了明显的特征性细胞病变(CPE):细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,偶见含有几个细胞核的巨大细胞;用标准抗IBRV特异性抗血清能完全中和分离株;用IBRV gB特异性引物进行PCR,可扩增出1 182 bp的特异性条带,目的序列与已发表的IBRV基因组序列一致。【结论】该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒,将其命名为IBRV XA株。