中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展

<正>中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室是由农业部2002年公布的第一批国家参考实验室,2017年6月1日,世界动物卫生组织(OIE)确认中国兽医药品监察所猪瘟实验室成为新的OIE猪瘟参考实验室,该实验室是国内最早开展猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)     

RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对Gen Bank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株(He BHH1/95)为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交的特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株(SM)接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5—6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示:8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10—24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi达到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

猪瘟病毒Thiverval株3′非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒（CSFV）疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3′-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3′-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3′-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3′-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。     

从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。     

猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用

 【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122）,阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。     

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。     

猪瘟病毒Thiverval株3''非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3'-UTR含有一定长度的插入序列.本研究通过反向遗传学操作,构建了3'-UTR含有19 nt、32 nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3'-UTR插入片段并不影响病毒的拯救.通过3'-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3'-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一.     

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.     

猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用

对猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的稳定性及保存条件等进行了摸索,确定该试剂盒具有良好的稳定性,并可在2℃～8℃环境中的保存9个月。同时,测定了本试剂盒与荧光抗体病毒中和试验的符合率为92.62%;并将该试剂盒应用于免疫动物抗体的动态监测。     

猪瘟病毒抗体ELISA检测国家级能力验证结果与分析

猪瘟疫苗免疫是我国猪瘟防控的核心，猪瘟病毒抗体ELISA检测是进行免疫效果评价的最常用手段。中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室（以下简称：参考实验室）承担了国家认证认可监督管理委员会（以下简称“认监委”）组织的A类能力验证项目“猪瘟诊断检测技术”（CNCA-19-A01），全面考察和评价我国动物疫病检测机构对猪瘟病毒抗体的检测能力。参考实验室负责制备检测样品，并进行随机编号。向每个参试实验室发放4份待检盲样，由其采用ELISA方法对各盲样进行定性判断，并向参考实验室提供检验结果及原始检验报告。出现“不满意”结果的单位可参加补测1次，若补测结果仍为“不满意”，则表明该实验室暂不具备该参数的检测能力。参加本次能力验证猪瘟病毒抗体检测的实验室共有103家，初测满意率为92.23%，初测和补测的总体满意率为100%。此次能力验证结果表明，参加此次能力比对试验的猪瘟检测机构均能够提供正确的检测结果，可以满足猪瘟病毒抗体监测的需求。通过本次能力验证项目查找出了存在的问题，参试单位可以及时纠正错误，进一步提升猪瘟抗体的检测能力。