牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

油菜和小麦种苗根系对乙草胺的耐性差异分析

为揭示油菜和小麦根系对乙草胺耐药性差异的原因,采用水培法研究了梯度浓度乙草胺对油菜和小麦种苗根系形态、根尖生理代谢和解剖结构的影响。结果表明,1 mg/L乙草胺对油菜根长抑制率为33.63%,而对小麦根长抑制率可达55.22%;100 mg/L乙草胺对油菜侧根抑制率为63.03%,而对小麦侧根抑制率达100.00%;经0.01 mg/L乙草胺处理后的油菜根尖细胞膜透性高于小麦,当乙草胺浓度高于0.1 mg/L后,小麦根尖细胞膜透性剧烈增加且高于油菜;在较高浓度乙草胺胁迫下,小麦根尖抗氧化酶活性均低于油菜;10 mg/L乙草胺处理下,小麦根尖的解剖结构变异较油菜明显,表现为细胞排列松散、混乱,根冠变形,分生组织细胞染色程度变浅,伸长区细胞分化提前,中柱鞘细胞木质化。研究表明,小麦的根系建成比油菜更容易受乙草胺抑制,且侧根数比根长更敏感;油菜和小麦对乙草胺耐药性差异可能与细胞膜透性、抗氧化酶活性以及根尖细胞组织分化等差异有关。     

3种化感作物水浸液对远志种苗生长的影响

用室内生物测定的方法测试3种化感植物（向日葵、高粱、玉米）叶片的不同质量浓度水浸液（0、 0.02 、0.025、0.033、0.05、0.1 g·mL^-1）对远志种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,3种水浸液在试验质量浓度范围内均对远志种子的发芽有低促高抑的化感效应,且质量浓度越高抑制效果越明显;3种供体材料的化感效应存在明显的供体植物种间差异,其抑制作用强弱表现为高粱>向日葵>玉米,对远志的最高安全质量浓度依次是0.025、0.033和0.1 g·mL^-1。其中玉米水浸液在质量浓度≤0.1 g·mL^-1时对远志的发芽率和发芽指数都是安全的,而且在最低质量浓度（0.02 g·mL^-1）的综合效应值为+0.004,表现为促进作用。因此,建议将玉米废弃秸秆作为首选材料进一步测试其废弃植株粉碎物对远志田杂草是否有抑制效果,以期为开发安全防治远志田杂草的植物源“除草剂”提供基础。     

广佳安对油菜芽苗根系形态结构及生理指标的影响

为研究除草剂广佳安对油菜根系的影响,以甘蓝型油菜陕油16和白菜型油菜白杂一号为材料,用室内水培法研究了不同浓度广佳安对2个油菜品种芽苗根系生长发育的影响。结果表明,广佳安明显抑制油菜根系生长,随着处理浓度的增加抑制作用增大;广佳安使油菜芽苗主根长度、根干重及根冠比都下降,根毛和侧根长度缩短,根毛密度减小,且扭曲、变形,交错缠绕,分布不均匀。芽苗所测根系的MDA含量、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)的活性都随广佳安处理浓度的增加而增大,超氧化物歧化酶(SOD)表现为先增高后降低的趋势。广佳安胁迫使根尖膨胀变粗,根冠由尖锥形变为近圆弧形,在较高浓度下,表皮细胞排列不整齐,甚至部分缺失;皮层薄壁组织细胞层数减少、细胞液泡化程度增高,细胞边缘皱褶溃烂。2个油菜品种相比,白杂一号对广佳安的耐药性较陕油16强。     

牛病毒性腹泻病毒蛋白的免疫学特性以及相关疫苗研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)众多基因亚型毒株的流行及其宿主谱的扩大干扰着BVDV防控工作。欧洲国家采用全面检测和扑杀BVDV阳性牛的方法达到一定防控效果，但结合我国实际生产情况，使用疫苗防控BVDV仍是最优策略。深入了解病毒感染过程中BVDV蛋白与宿主免疫系统之间的“博弈”,将有助于研究人员在疫苗研发过程中有效规避抗原候选蛋白可能对免疫效果造成的干扰。此外，大力开发低成本、高效力的新型疫苗(如表位肽疫苗和病毒样颗粒疫苗)可以在整合病毒免疫优势抗原表位的基础上加强BVDV相关疫苗的生物安全性，满足用疫苗防控BVDV的要求。鉴于此，本文对BVDV蛋白免疫学功能与特性的研究以及BVDV疫苗开发的现状进行综述，以期为BVDV疫苗研发以及BVDV防控提供一些理论指导。     

一株牦牛源牛病毒性腹泻病毒毒株的分离鉴定及其遗传特性分析

通过病毒分离培养技术,从牦牛血清中分离获得一株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为GSTZ毒株。经电镜观察,GSTZ毒株的直径在50~60 nm。按Karber法测算,该病毒滴度为5.0×10^6.5 mL^-1[以组织半数感染量(TCID₅₀)计]。利用反转录PCR(RT-PCR)测定GSTZ毒株的完整开放阅读框(ORF),全长11 691 nt,将其与参考毒株ORF在核酸序列和同义密码子使用模式等方面进行分析,确定GSTZ毒株在遗传学特性上属于基因1型家族成员。在GSTZ毒株的完整ORF中,A+U的出现频率要高于G+C,而且,病毒同义密码子的使用模式体现出对U/A结尾同义密码子使用偏嗜性高的遗传学特征。GSTZ毒株明显降低了使用含有CpG二联核苷酸的同义密码子的频率。这有助于降低病毒对宿主细胞免疫系统的刺激强度,从而促进病毒的复制增殖。研究成果可为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料,并为BVDV不同基因型的抗原关系分析与BVDV疫苗的研制奠定基础。     

羊边界病致病机制及宿主嗜性变化的研究进展

羊边界病病毒(border disease virus,BDV)属于黄病毒科瘟病毒属,经常在牛、羊等反刍动物群体间广泛流行传播,能以多种动物为宿主且对健康动物具有一定危害。BDV感染反刍动物可引起持续性感染和免疫抑制,给畜牧业造成严重危害,且在多个国家和地区呈现出一定的流行性趋势。目前尚无公认的有效疫苗来预防BDV,所以如何科学饲养以及做好安全防控就成了重中之重。本文对BDV在牛群、羊群内的传播进行研究分析,有助于人们对BDV可能造成的风险进行预估并进行防控。因此,从BDV的分子生物学、流行现状、流行病学、临床症状以及与牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的混合感染来进行研究分析,有助于人们深入了解BDV致病及传播扩散的生物学机制,为该病的诊断、防治和疫苗研发提供新思路和策略。     

三株分离于新生小牛的牛病毒性腹泻病毒株的基因组特征

为研究我国不同地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染新生小牛的遗传演化规律。以实验室保存的来自山东、内蒙古和宁夏的新生荷斯坦小牛血清为材料，利用RT-PCR方法对小牛血清进行BVDV RNA检测，并将检测为阳性的血清接种于牛肾细胞(MDBK),经分离鉴定获得3株BVDV野生株，分别命名为21NM-44、21NX-53和21SD-16。根据3株病毒对MDBK细胞的致细胞病变能力，判定21NM-44为非致细胞病变型毒株，21NX-53和21SD-16为致细胞病变型毒株。利用特异性PCR引物，克隆鉴定得到3株病毒的全基因组序列，依据全基因组序列建立系统进化树并分析其遗传演化关系。结果表明，3株来自不同地区的BVDV野生分离株与BVDV GXNN1毒株(BVDV-1c)具有高度的遗传演化关系，而BVDV-1c作为优势流行株存在于我国新生荷斯坦小牛。本研究结果可以为进一步研究BVDV在我国的演化规律奠定基础。