5株H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析和豚鼠间传播能力的评估

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在哺乳动物间的传播能力,本研究以豚鼠为模型评价了5株H9N2亚型AIV在豚鼠体内的复制能力和水平传播能力,并分析了5株病毒血凝素(HA)蛋白的分子特征。结果表明,5株病毒均属于CK/Beijing谱系,其中2株病毒的HA具有人样受体特征(Lys226),2株病毒具有禽样受体特征(Gln226),而A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)株在该位点的氨基酸残基为苯丙氨酸(Phe226)。裂解位点分析表明,5株病毒均具有低致病性AIV特征。个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。感染试验表明,5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制。并且在鼻甲骨处复制稳定,平均病毒滴度为2.01 Log EID50/mL～4.5 Log EID50/mL。传播试验表明,所有病毒株的人工接种豚鼠的鼻洗液中均能够检测到病毒,最长排毒期为接毒后第8 d,而接触组豚鼠鼻洗液中未检测到病毒。本研究表明,5株H9N2亚型AIV均属于CK/Beijing谱系,部分病毒株的HA蛋白已具备人样受体结合特征,并且关键氨基酸位点(226位)处出现新的突变。5株病毒均能够在豚鼠呼吸道复制并通过上呼吸道排毒,但不能在豚鼠间同群传播。     

A型流感病毒研究进展

从A型流感病毒宿主范围、病毒结构、病毒蛋白种类及功能、流感大流行、禽流感病毒跨种传播等方面综述了目前A型流感病毒研究的最新进展,旨在为今后A型流感病毒的研究提供借鉴和参考。     

A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备

为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在其间引入合适的linker序列,重组得到pET-28a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。成功构建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表达载体,获得高纯度重组蛋白和含A型口蹄疫病毒抗体的兔抗血清,为A型口蹄疫病毒诊断试剂盒的研发和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基础。     

不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析

为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV （CP型BVDV）和非致细胞病变型BVDV （NCP型BVDV）感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72 h期间每间隔12 h收集1次细胞,同时对24、48 h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24 h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48 h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。     

抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体基因的克隆与序列分析

从分泌抗新城疫HN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA,经RT-PCR扩增抗体轻、重链可变区基因,然后与L inker连接组装成单链抗体基因(scFv),其排列方式为VL-linker-VH。结果,成功地构建了scFv基因,序列分析表明,scFv基因长为744 bp,其中VH基因长为366 bp,VL基因长为333 bp。单链抗体基因的构建为抗新城疫HN蛋白基因工程抗体的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型SD2分离株ORF3基因转录分析

对PCV2 SD2株(DQ478947)进行了序列分析发现,其含有11个开放阅读框,与以往分离株开放阅读框有较大差异.根据GenBank发表的PCV2序列设计特异性引物,扩增ORF3基因,预计扩增片段大小为209 bp.分别在接毒后12、24、36、48 h,用Trizol法自病毒细胞裂解液提取总RNA,然后用DNase I处理,除去残留的病毒DNA,利用醋酸纤维素分离mR-NA,用上述引物进行RT-PCR扩增.在接毒24 h后扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与PCV2 SD2(DQ478947)ORF3基因序列相符.由此证实,PCV2山东分离株ORF3基因可在接毒24 h后于转录水平表达,为ORF3基因的深入研究打下了基础.     

副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用

本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白和ELISA方法用于牛副结核病临床样品检测,并对检测数据进行分析。结果表明,以MAP0862蛋白为检测原建立的ELISA检测方法在临床样品检测中具有较高的特异性和敏感性,说明MAP0862蛋白适用于副结核病抗体检测。本研究建立的ELISA检测方法可有效检测临床样品中副结核病的感染。     

2017—2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况，2017—2018年，在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场，采集624份犊牛腹泻病料样品，进行牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛肠道病毒（BEV）、牛冠状病毒（BCoV）和牛轮状病毒（BRV）PCR检测，并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析（Pearson卡方检验）。结果显示：BVDV、BEV、BCoV、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%，群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%，BVDV检出率显著高于其他3种病毒（P<0.01），且有流行加重趋势；鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异，其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区（P<0.01）。结果表明，BVDV、BEV、BCoV、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛，以BVDV流行最为严重，尤其是鲁中地区，且有流行加重趋势，成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素，建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况，可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。     

H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析

【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD₅₀为10^3.5EID₅₀,10⁶EID₅₀、10⁵EID₅₀、10⁴EID₅₀攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为10⁶-10³EID₅₀的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3-8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在10⁶EID₅₀时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。