山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

从山东某地区发生呼吸道症状的奶牛场中采集样品,按常规方法处理后,接种牛肾细胞(MD-BK),分离病毒,盲传3代后,接种病料的MDBK细胞出现细胞圆缩、聚集成葡萄串样群落、在单层细胞上形成空洞等病变,且随着传代次数的增加,细胞病变更加规律。对所分离病毒进行TCID50测定,其TCID50值为108/ml;用IBRV特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,序列测定分析结果确认所分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒。     

牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定

利用BHK-21细胞,接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血,经盲传3代,分离到1株病毒,经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒,命名为BEFV-SD。理化特性试验表明:BEFV-SD对热敏感,56℃10 min、37℃18 h可被灭活,对乙醚、氯仿等敏感;BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和,中和效价为1∶408;将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较,同源性达到96.3%以上。     

奶牛腹腔巨噬细胞的分离与鉴定

以无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,分离获取奶牛腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,并通过瑞氏染色计算其纯度。结果表明,采用无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,能够获得较高纯度的巨噬细胞,能为奶牛胞内寄生菌存活机制的研究提供很好的试验材料。     

牛种布鲁氏菌SP41基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的牛种布鲁氏菌SP41基因序列,设计合成了一对特异性引物。从牛A19疫苗中提取全基因组DNA作为模板,PCR扩增出SP41基因,连入pEASY-T3载体,测序结果表明,扩增的片段含有1 302个核苷酸,编码433个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的布鲁氏菌2308、A-13334、S19、9-941序列的氨基酸同源性为100%;与布鲁氏菌ATCC、CCM4915、M28、M5-90、NI的氨基酸同源性为99.8%。布鲁氏菌SP41基因的克隆,为获得重组SP41蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的研究进展

非结构蛋白NS3是致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒的分子标记蛋白,它具有多种生物学功能。研究结果表明,NS3在病毒非结构蛋白的加工、成熟、基因组复制与转录过程中以及宿主细胞致细胞病变效应的产生中起重要作用。文章总结了NS3的生物学特性及其相关功能,为阐明NS3的致细胞病变作用机理奠定基础。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

RNA-Seq技术在动物病毒传染病学研究中的应用

病原与宿主相互作用,是构成感染的基本因素,RNA-Seq技术的发展推动病原与宿主相互作用研究,已进入全方位系统分析整个转录组水平,能够从整体水平研究差异表达基因以及基因功能,揭示特定生物学过程以及病毒致病的分子机理。现主要介绍了RNA-Seq原理、技术特点及其在动物病毒感染研究中的应用,简略地分析了该技术的不足之处,并对其应用进行了展望。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析

为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV （CP型BVDV）和非致细胞病变型BVDV （NCP型BVDV）感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72 h期间每间隔12 h收集1次细胞,同时对24、48 h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24 h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48 h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。