两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒

为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的重组腺病毒,首先把骨架质粒pAdeasy-1通过化学法转化到氯化钙法制备的E.coli BJ5183感受态菌中,通过含氨苄青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒的阳性菌BJ5183/p,再次用化学法把插入有猪圆环病毒2型ORF2基因的穿梭质粒rpShuttle-CMV-276经PmeⅠ酶切线性化后转化到BJ5183/p感受态细胞中进行同源重组,再在含卡那霉素的LB平板上培养,筛选出卡那霉素抗性菌进行质粒抽提纯化,酶切并电泳鉴定,获得重组阳性质粒rPAD-276.结果表明,运用2步化学转化法构建重组腺病毒质粒是一种简便、快捷且容易操作的方法.     

大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法的改进

介绍一种改进的大规模ESTs筛选的方法。以SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建的毛冠鹿大脑cDNA文库为研究材料,基于该文库噬菌体可自发转化为质粒的特点,直接把噬菌体文库转化为质粒文库。随机选取平板中转化后的质粒cDNA文库克隆,振荡培养后运用菌液电泳的方法代替传统的PCR筛选法,对重组克隆进行筛选。改进的菌液电泳法可以准确鉴定出重组的质粒,并估计出插入片段的大小。该方法能更好地保持SMARTTM cDNA Library Construction Kit所构建文库的完整性,是一种简单、高效、适用于大规模表达序列标签筛选的有效方法。     

一种用于高效筛选极端酶突变基因的质粒营救法

为简化定向进化筛选突变耐高温和耐酸碱酶等极端酶的繁复工作,建立了一种快速质粒营救法,可直接从加热处理的平板中回收携带有突变基因的质粒,用于进一步的随机突变基因的筛选和基因测序等.研究了在不同的热处理条件下的质粒营救效率,获得了质粒营救转化效率最高的处理条件.结果表明,本方法适于质粒大小在2～10 kb范围的载体,可用于平板筛选最适酶活性温度在60～100℃、pH 4～10的突变体酶,并可将一轮的筛选过程缩短1～2 d.     

快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验

利用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)直接裂解细菌菌液,通过电泳与空质粒DNA载体进行比较,探讨了一种快速鉴定重组质粒的简单方法。该方法在细菌菌落快速裂解法的基础上进行了改进,既保留了细菌菌落快速裂解法简单方便、成本低廉的优点,同时又克服了细菌菌落裂解法因菌落大小有限以及裂解液粘度大、易于被带出点样孔,致使有时产生假阴性现象的不足,利用该方法鉴定cDNA文库质量时,可以克服菌落较小的限制。     

小提质粒快速排除假阳性克隆的新方法

对传统的小提质粒方法进行了简化,在15 min内提出重组子质粒,从而快速地排除不含质粒的假阳性菌落.为验证方法的可靠性,构建了7个重组子,并应用PCR方法进一步对筛选结果进行鉴定.结果表明:此方法简便、迅速、可靠、重复性好,适用于革兰氏阴性菌,可以先排除一部分假阳性克隆,缩小筛选范围.     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

猪hepcidin基因质粒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。     

嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA高活性启动子的克隆

将从嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA获得一段约1.4kb的DNA片段克隆进启动子探针载体pKK232-8,转化大肠杆菌HB101获得重组质粒PAS1(具有很强启动活性),可抗Cm达1 000 μg/mL.实验采用亚克隆技术,经过提取质粒、酶切、电泳、回收、连接等步骤将该有启动活性的插入片段缩小,欲获得一段有强的启动功能的最小活性片段.首先通过单酶切图谱发现该插入片段上有3个单酶切位点即kpnI、BglⅡ和PstI;再将双酶切所得各DNA片段设计为不同的方案,或直接连接,或末端补平连接,或亚克隆处理,以启动子探针质粒pKK232-8为载体,转化大肠杆菌HB101,利用氯霉素平板筛选重组质粒.结果表明,该插入片段的活性功能存在于Kpn1和HindⅢ双酶切所得的一段约300 bp的DNA片段,将该小片段进行亚克隆所得重组质粒PAS1-3仍有很强的Cm抗性.     

PCR鉴定重组质粒方法的改进

为建立重组质粒DNA的快速鉴定方法，分别以阳性菌的菌斑，菌液的菌丝体以及质粒DNA为模板进行PCR鉴定重组质粒。结果表明：以菌斑或菌液的菌丝作为模板的PCR鉴定方法操作步骤便捷，结果可靠，可以作为重组质粒初步的筛选方法。     

寄生疫霉ParA1蛋白在毕赤酵母中的表达

本研究构建ParAl蛋白真核表达系统,通过诱导表达、镍柱纯化等途径,获得具有高生物学活性的ParA1蛋白.将末端含6×His-tag的parA1基因整合到酵母胞内表达质粒pPICZ-A上,获得重组表达质粒pPICZ-A::parA1-His.重组表达质粒用BstX I酶切线性化后,电转化至毕赤酵母菌KM71H中,经含抗生素Zeocin的平板、MD平板筛选和PCR分析,鉴定得到阳性克隆.甲醇诱导重组酵母菌中ParA1蛋白表达,然后用镍柱纯化表达产物.Tricine-SDS-PAGE电泳检测发现,纯化后收集的蛋白电泳条带清晰单一,浓度约为75 mg/L.生物学活性检测表明所得的ParA1蛋白有较高生物学活性,在稀释6 000倍后仍可以强烈诱导烟草产生过敏反应.     

人组织激肽释放酶在Pichia pastoris酵母中的表达

通过将人组织激肽释放酶(hKLK1)原编码序列克隆入Pichia pastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-KLK1.分别用Sal Ⅰ及Bgl Ⅱ酶切线性化后电转化酵母菌株GS115,经MD平板及含不同抗性浓度G418的YPD平板上培养筛选,获得抗3 mg/ml G418 Mut+型分泌表达hKLK1的重组酵母菌4株,抗1 mg/mlG418 Muts型分泌表达hKLK1的酵母菌3株.酶活性测定数据表明:高拷贝转化子重组蛋白表达量高于低拷贝转化子;Mut+型转化子重组蛋白表达量高于Muts型转化子;且当甲醇诱导体积分数为2%时,重组蛋白的表达量最高.进一步的Western-blotting分析证明,表达的重组hKLK1分子质量正确,能被特异的抗体识别.     

冰岛硫化叶菌反螺旋酶基因的遗传学分析

根据同源重组的原理,构建了用于敲除冰岛硫化叶菌中反螺旋酶(RG)基因的质粒pRG.重组质粒反复转化冰岛硫化叶菌,得到质粒整合到宿主染色体上的单交换菌株,但没有获得反螺旋酶基因缺失的双交换转化子.由此推测反螺旋酶基因是冰岛硫化叶菌必需的功能基因,敲除反螺旋酶基因可导致细胞死亡,或者转化菌株为生存需要存在某种未知机制而阻止双交换发生.单交换菌株可以再次发生同源重组,通过PCR的方法,证实再次重组得到的皆为回复突变而无缺失突变菌株.     

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白主要抗原位点在昆虫细胞中的表达

用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达.     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究

对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明：该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISPl．pBIPl,pBIAP1和pBISgpl20分别导入根癌农杆菌EHAl05和LBA4404,构建了植物双元表达载体,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化提供了良好的载体系统。     

酵母菌生长曲线的测定及其转葡萄芪合酶基因重组菌遗传稳定性的检测

采用分光光度计比浊法测定酿酒酵母INVSc1的生长曲线,确定菌体生长规律;并以此为依据,制备酿酒酵母感受态细胞,进行葡萄芪合酶基因酿酒酵母重组质粒的转化;采用菌落PCR法快速鉴定阳性重组子,并进一步检测重组质粒在重组菌中的稳定性.结果表明,于酵母菌对数生长中期(OD600为0.8时)进行重组质粒的转化,可以得到较高的转化效率;在0～72 h发酵培养过程中重组质粒在宿主菌中的稳定性达到100%.这为后续工作开展葡萄芪合酶基因在酿酒酵母中的诱导表达研究奠定了技术基础.     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC 57质粒中测序后,用EcoR I 和Not I双酶切,连接到pPIC 9 k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子.0.5%甲醇诱导表达96 h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0 kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符.用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329 mg/L.     

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

提取C型节瘤拟杆菌染色体DNA。用PCR技术从腐蹄病C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原085kb纤毛蛋白基因（pili基因），将PCR产物pili基因克隆于TE载体，在含X-gal和IPTG的Amp LB平板上，挑选白色单一菌落进行质粒的筛选，用EcoR1酶切提取重组质粒，琼脂糖凝胶电泳，出现一条0．85kb的条带，从而筛选出TE-pili重组质粒。对pili基因进行序列测定，结果与国外报道的pili基因序列一致。     

新城疫病毒F48E9株和La Sota株F基因在Bac-to-Bac昆虫杆状病毒系统中的表达

将新城疫病毒(F48E9株和La Sota株)F基因插入至杆状病毒转移载体pFastBacTMHT A中,分别构建重组质粒pFastBacHT-F48F,pFastBacHT-LaF,然后转化E.coliDH5α,以LB/AMP±平板筛选阳性重组子并测序。测序正确后转化至E.coliDH10Bac感受态细胞中,经抗性培养和蓝白斑筛选,筛选出白色菌落后,提取重组Bacmids(分别命名为rBacmid-F48F和rBacmid-LaF),经PCR鉴定正确后,将阳性重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞。在昆虫细胞内,重组Bacmid经复制,表达,装配,形成重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实NDV F48E9株和La Sota株的F蛋白均获得正确表达,所表达的重组F蛋白分子量约56 kD,证明在昆虫细胞内表达并部分糖基化,具有良好的免疫原性,为表达F基因并建立适合国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。