"西藏雪莲"中乳酸菌的分离鉴定及发酵性能研究

将"西藏雪莲"转接纯化3次后对其进行整体切片镜检,并用加有CaCO3的鉴别性培养基,利用乳酸菌溶钙性产生透明圈将其与其他菌区分。所获得的乳酸菌进行分离纯化、鉴定,结果共鉴定出乳酸杆菌2株、双歧杆菌1株、乳酸球菌3株。最后对这些菌株的发酵性能进行测定,并进行组合发酵试验,从中获得人体有益菌和性能优良的乳酸复合发酵剂。     

牛金属硫蛋白素bMTcin编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

以本实验室由RT-PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白（bMT）cDNA的重组质粒pYJ101为模板，PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区，将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T-1，在E.coli中诱导表达bMTcin，经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明，所克隆的bMTcin序列全长为141bp，其DNA序列与原模板中的序列完全相同，与GenBank中另外5个bMTcinDNA相比，第31位和86位与Conneely的序列为A和G，导致第11位（Thr）第29位（Arg）的氨基酸不同于其他4个序列（11位为Ala，29位为Lys）。融合表达蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。     

基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建

为了预测和监控冷鲜猪肉储存过程中腐败细菌大肠杆菌的变化规律,评估产品货架期,建立微生物生长预测模型。该研究将绿色荧光蛋白质粒pGFP转入大肠杆菌DH5α,构建GFP的标记大肠杆菌。基于绿色荧光蛋白报告基因和氨苄青霉素抗性,采用稀释平板法定量追踪检测0～24℃条件下冷鲜猪肉中DH5α生长变化。采用Gompertz模型、平方根模型和响应面方程进行数据拟合,构建数学预测模型。结果表明Gompertz模型拟合效果良好,0～20℃条件下决定系数R2为0.96～0.99。温度与最大比生长速率平方根、延迟期倒数平方根模型R2分别为0.862、0.948。响应面模型揭示时间、温度对大肠杆菌的生长影响显著(P0.05),二者交互作用明显,响应面模型R2为0.815。模型能够有效拟合冷鲜猪肉中与温度、时间相关的大肠杆菌的生长变化规律,研究结果为产品储存过程中细菌变化预测提供理论依据。     

λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因

采用PCR法合成了stx2基因上游和下游的2个同源臂序列分别为1635,1655bp。2个同源臂序列被克隆到载体pCR2.1-TOPO上,两臂中间插入庆大霉素抗性基因Gm(855bp),构建了stx2基因敲除盒子pCR2.1-B-Gm-A。将含2个同源臂和Gm抗性基因片段的扩增子电转化到含质粒pKM208的感受态细胞EHECO157:H7中,通过λ-Red重组系统产生了stx2基因敲除突变菌株。用Verocell试验检测了突变株的产毒能力并进行了细胞黏附试验。结果表明,合成同源臂利用λ-Red重组系统可以有效的敲除EHEC毒素基因,stx2基因敲除后的突变株不产stx2毒素,对真核细胞CaCo-2和Hep-2的黏附能力明显降低。     

嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA高活性启动子的克隆

将从嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA获得一段约1.4kb的DNA片段克隆进启动子探针载体pKK232-8,转化大肠杆菌HB101获得重组质粒PAS1(具有很强启动活性),可抗Cm达1 000 μg/mL.实验采用亚克隆技术,经过提取质粒、酶切、电泳、回收、连接等步骤将该有启动活性的插入片段缩小,欲获得一段有强的启动功能的最小活性片段.首先通过单酶切图谱发现该插入片段上有3个单酶切位点即kpnI、BglⅡ和PstI;再将双酶切所得各DNA片段设计为不同的方案,或直接连接,或末端补平连接,或亚克隆处理,以启动子探针质粒pKK232-8为载体,转化大肠杆菌HB101,利用氯霉素平板筛选重组质粒.结果表明,该插入片段的活性功能存在于Kpn1和HindⅢ双酶切所得的一段约300 bp的DNA片段,将该小片段进行亚克隆所得重组质粒PAS1-3仍有很强的Cm抗性.     

鸡腿蘑优良新品种CC007的选育研究

以CC001、CC002、CC003、CC004、CC005、CC006为亲本进行单孢杂交，纯拮抗试验和品比试验结果表明，其中6个杂交新菌株产量明显高于亲本，以CC007产量最高，生物学效率达107.7%，杂交优势为64.7g／袋，为优良的鸡腿蘑新品种。     

鸡腿蘑覆土机理研究初探

本研究从物理，化学和生物方面研究覆土对鸡腿蘑子实体化及生长影响，初步解释鸡腿蘑覆土机理。结果表明，土壤中微生物是导致子实体分化的主要原因。     

果蝇抗菌肽基因（Andropin）的原核表达与活性分析

【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌活性试验表明,表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。【结论】重组工程菌表达得到Andropin的融合抗菌肽,且其具有抗菌生物学活性。     

纳他霉素高产菌株的诱变选育

以褐黄孢链霉菌(ATCC13326)为出发菌株,紫外诱变后,结合链霉素抗性筛选法选育纳他霉素高产菌株.原始菌株活化后,测定其最小链霉素抑制质量浓度为8 μg/mL.采用90% 的紫外致死剂量,照射108 mL-1 ATCC13326孢子悬液,诱变后涂布于8 μg/mL链霉素选择培养基上,筛选链霉素抗性突变株.通过形态指标初步选择5株突变株进行发酵性能测定,种子培养26 h,摇瓶发酵96 h,用紫外分光光度计在303 nm下测定其吸光值,计算纳他霉素发酵产量.结果表明原始菌株纳他霉素发酵产量为1.229 g/L,诱变获得的两株高产突变株纳他霉素发酵产量分别为1.552和1.776 g/L,分别高出原始菌株26.3%、44.5%.