IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的研究

结合ELISA和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的特点,引入了另外一种方法,即免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)对葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了检测。从免疫捕捉病毒、释放RNA到反转录成cDNA,最后扩增出了约300bp的预期目的片段。为了进一步明确PCR扩增的特异性,将PCR产物连接到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌E.coliJM109菌株,通过蓝白斑筛选,获得重组质粒,提取质粒DNA,经酶切对重组质粒进行鉴定,结果得到了含有目的片段的重组质粒。由此证明,IC-RT-PCR检测GLRaV-3结果准确可靠。最重要的是它弥补了ELISA易出现假阴性、假阳性以及RT-PCR提取RNA难等的缺点,不失为病毒检测的新型方法。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

新城疫病毒JZ05株F基因重组pGAPZα的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株,基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶κpnI和XbaI对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化Eacterium coli DH5α.以PCR方法确定JZ05 F1的阳性重组子为2个,JZ05 F2的阳性重组子为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果发现,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1198bp、269bp,与新域疫病毒JZ05株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.这表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2、研究强毒株与弱毒株F蛋白的抗原性差异程度及研制重组亚单位疫苗打下了基础.     

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Wester...     

假肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides 1159)的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19 ku的特异蛋白条带。     

新城疫病毒Mukteswar株F基因重组pGAPZα-F的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒Mukteswar株F基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶Kpn I和Xba I对目的基因片段及质粒pCAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化E. coli DH5α.以PCR方法确定Mukteswar F1和Mukteswax F2的阳性重组子均为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1 198 bp、269 bp,与新城疫病毒Mukteswar株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.结果表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2,研究Mukteswar株与基因Ⅶ型毒株之间F蛋白的抗原性差异程度打下基础.     

水稻基因组文库的构建及YR-DNA的筛选

为了克隆决定染色体形成的特异DNA片段YR-DNA,以λExCell为载体,克隆经限制性内切酶EcoRI消化后的水稻基因组DNA,λ噬菌体体外包装构建了滴度为1.2×106 pfu/ml,重组效率达86%的小型水稻基因组文库.随机选取了50个重组克隆,质粒释放后进行酶切鉴定,插入序列的大小为0.5～7 kb,平均为3 kb.以水稻基因组DNA为探针对基因组DNA文库进行筛选,从10 000个重组子中选出200个杂交信号较强的阳性克隆,质粒释放后点渍杂交进行第2轮筛选,从中选取40个杂交信号较强的重组子,再次进行斑点杂交,选取10个杂交信号最强的重组子.酶切并回收基因组插入片段,标记特异的重组片段,与不同酶切后的水稻基因组DNA进行Southern杂交,其中有两个探针杂交后基因组酶切带上杂交信号呈弥散状,表明重组片段为散在重复序列.     

表达重组鸡新城疫病毒免疫原蛋白基因的研究

以ＮＤＶ ＨＮ基因重组禽痘病毒载体与禽痘病毒转染液为材料,以载体质粒的ＬａｃＺ报告基因为筛选标记,在含有Ｘ－ｇａｌ的培养基上筛选蓝色空斑的阳性重组子,对初次筛选到的蓝色空斑经过三轮蚀斑纯化,得到了能稳定增殖的病毒子,再分别提取病毒子感染细胞,正常对照细胞基因组ＤＮＡ,ＢａｍＨ Ｉ酶切后,以ＤＩＧ标记的探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测,发现重组病毒感染的细胞基因组ＤＮＡ在７ｋｂ处有一ＤＮＡ片段,能与     

人蛋白激酶CK2 3个亚基cDNA的克隆与测序

目的构建人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基cDNA重组表达质粒深入进行CK2结构与功能的研究.方法利用RT-PCR、定向克隆和DNA测序等进行本实验.结果通过反转录PCR从HL-60细胞中获得了人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基编码区cDNA,将Nde I /HindⅢ双酶切的3种PCR产物分别与同样双酶切的表达载体pT7-7进行定向连接.CaCl2法分别转化DH5 α获转化子,快速提取质粒DNA进行电泳初筛得到阳性克隆.限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符.每种CK2亚基都各随机挑选4个阳性克隆,PEG法进行纯化.采用PE ABI的Big Dye荧光标记的终止底物循环测序试剂盒,使用各种引物进行正反向DNA测序.通过测序分别在每种CK2 α、α′和β亚基的4个阳性克隆中筛选到2个、1个和2个含完全正确的人CK2 α、α′和β亚基cDAN的重组质粒克隆,其余的克隆均存在1～2个碱基突变.我们将这种含正确序列的重组质粒分别命名为pTCKA、pTCKA′和pTCKB.结论CK2全套3个亚基重组质粒克隆的成功,将为在原核细胞中表达人CK2 α、α′和β亚基以及利用人CK2 α、α′和β cDNA作为探针进行深入研究打下基础.     

青天葵EBP1基因原核表达载体的构建(英文)

[目的]构建青天葵器官大小调控基因———Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切进行验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coliBL21表达宿主细胞后,获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

车牌字符提取中的矫正和切割算法研究

针对车牌字符提取中的图片矫正和切割关键部分，提出了一种基于Hough变换的车牌字符倾斜角度的自动检测矫正算法．在此基础上提出了一种基于边缘分析的二值化算法的投影判断法．对字符目标的灰度和纹理分布进行优化提取．经实地测试检验，字符切割的正确率提高了15％．     

差异蛋白质组学在植物研究中的应用

差异蛋白质组学是蛋白质组学的研究策略之一,主要目标是研究有意义的因素引起的蛋白质组成的变化以发现有差异的蛋白质。介绍了差异蛋白质组学应用于植物研究中的基本方法和新兴技术。植物样品制备方法主要为TCA/丙酮法和植物组织分级提取法。2-DE仍是目前主要的分离方法,多维液相色谱等新型分离模式可以弥补2-DE的不足,新型质谱和蛋白质芯片技术的应用可大大提高差异蛋白质的鉴定速度。差异蛋白质组学目前在植物生理、植物组织器官和亚细胞、植物突变体、植物遗传多样性等多方面研究中都有应用。     

意大利杨木单板柔化处理的研究

为了改进意大利杨木单板的干燥质量，采取有规律切断意大利杨木单板的部分纤维。实验证明，采用此种柔化处理过的意大利杨木单板的干燥质量有明显的提高，能大大提高成品细木工板的表面质量。     

采用四步削茧鉴蛹法减少家蚕原蚕后期死蛹发生

[目的]减少家蚕原蚕后期死蛹发生,提高家蚕一代杂交种生产的经济效益.[方法]以家蚕原种春蕾（中系品种）与镇珠（日系品种）为研究对象,以原蚕后期死蛹率、发蛾率和工效为考核指标,对比四步削茧鉴蛹法与常规削茧鉴蛹法在家蚕一代杂交种生产中的应用效果.[结果]采用四步削茧鉴蛹法处理的原蚕死蛹率（3.01％）较常规削茧鉴蛹法（14.13％）下降了11.12％（绝对值）,二者间存在极显著差异（P＜0.01）.在工效方面,两种削茧鉴蛹法操作的工效无显著差异,且越是蚕蛹发病率高的生产批次,应用四步削茧鉴蛹法的成效越明显.2011～2012年在山东广通蚕种集团公司的部分蚕种场推广应用,结果显示,山东广通蚕种集团公司蚕种场的原蚕后期死蛹率明显减少,发蛾率由应用前在70.00％～90.00％波动提高稳定在92.00％以上.[结论]在家蚕一代杂交种生产过程中,合理运用四步削茧鉴蛹法可极大减少病原物通过蛹体间接触的水平传播感染,有效减少死蛹发生,显著提高制种效益.     

盆栽苏铁展叶规律及叶形控制技术研究

通过对不同水分控制的盆栽苏铁新叶生长对比,得出苏铁主叶、针叶的生长规律,控制水分可缩短苏铁主叶长度４３．１％,并使叶形弯垂,叶姿优美,大大提高了盆栽苏铁的观赏价值．总结出苏铁展叶过程中的水分控制技术,结合机械控制措施,可为苏铁盆景制作中的叶形控制提供指导．     

基于CAZAC序列的MIMO-OFDM定时同步算法

针对MIMO-OFDM系统定时同步中的精确度问题，提出一种基于CAZAC序列的定时同步方法。通过CAZAC序列优化帧的定时目标、准确度以及结构，使得帧和符号同步同时实现，简化定时算法。帧同步和符号同步的联合实现，降低了定时算法的计算量并能够准确定义信道的第一径，能够在时域实现整数频偏的估计，在提高同步精度的同时降低了系统的复杂度，通过仿真验证了算法在Rayleigh衰落信道中性能的明显改善。     

PC-1500计算机软件扩充数据存贮量方法的研究

扩充计算机内存容量的方法有多种,但如果采用本文的研究成果,则会使PC—1500计算机又增添几个独特的优势:数据存贮量可扩大2～4倍,数据存贮可得到自我保护,数据转贮时间可大为缩短。     

植物组织培养新技术——暴露培养法

本文涉及组织培养领域的一种新技术。它的基本特征是试管苗或脱毒苗生长在特制的敞口容器中。培养基和外植体由一层粉末材料覆盖,它可以有效地阻止微生物污染而不阻止脱毒苗茎叶的生长和钻出粉末层,阻止水分外渗而不阻止氧气渗入。由于茎叶暴露于容器外部,接受自然光的直射和干燥通风等条件的锻炼,试管苗生长矮壮、色绿,不用练苗而移栽成活率很高,其素质接近常规繁殖的幼苗。暴露培养法可以克服传统组培技术由于封闭系统方式而造成的幼苗娇弱,移栽后成活率低以及成本过高等固有缺点。     

抑枝素对缓和果树极性效应的研究

用植物生长调节剂——抑枝素羊毛脂软膏涂抹背上短截枝条剪口，其新梢生长量明显减弱，同时出现顶端优势逆转现象。此效应使所萌枝条有利于转化为结果的枝条类型；所萌枝条的空间排列有利于光能利用，从而有利于将背上徒长枝改造成充分利用空间、结构合理的结果枝组。在抑枝素的使用中以高浓度（９０×）的效果最为明显。     

山羊松果体细胞原代培养及其生物学特性研究

目的:观察体外培养山羊松果体细胞的增殖情况和功能状态．为进一步提高季节性繁殖动物的繁殖率提供理论基础。方法:对松果体细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,5-HT免疫组织化学染色显示细胞的功能状态。结果:松果体细胞呈圆形或多角形,折光性强,细胞体积有增大趋势;细胞有明显的增殖现象,大约于11d达到高峰;5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。结论:山羊松果体细胞在体外增殖旺盛。