重组人PRL-3蛋白的表达、鉴定和酶动力学分析

目的构建融合蛋白pColdII-His-PRL-3表达质粒,并进行诱导表达、纯化、鉴定和酶动力学分析。方法 2＋通过基因重组技术构建pColdII-His-PRL-3融合蛋白表达载体,并在ArcticExpress E.Coli中表达融合蛋白。经Ni-NTA层析纯化,PRL-3蛋白用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定,基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）确证,并进行酶动力学分析。结果重组载体pColdII-His-PRL-3包含正确的PRL-3编码序列,经IPTG诱导后能正确表达融合蛋白,Westernblot显示表达蛋白具有抗原性,质谱分析结果显示目的蛋白氨基酸序列与-1PRL-3蛋白完全相符。PRL-3酶的米氏常数Km为6.59μmol/L,催化常数Kcat为0.44min。结论构建的pColdII-His-PRL-3重组载体可表达具有酶活性的PRL-3蛋白,为PRL-3酶抑制剂的筛选奠定了基础。     

PKC、PKA和TPK在血小板激活中的作用

目的：研究蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ），蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ），酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）在血小板聚集激活中的作用。方法：本实验是在阿斯匹林阻断花生四烯酸代谢，Ａｐｙｒａｓｅ去除ＡＤＰ情况下，利用３２Ｐ－ＮａＨ２ＰＯ４标记猪血小板，然后以ＰＭＡ、凝血酶、ＰＧＦ１、腺苷等处理。以血小板聚集仪测定血小板聚集；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离血小板蛋白；并进行放射自显影；碱处理电泳凝胶检测酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）底物；ＴＬＣ进行磷酸氨基酸分离。结果：（１）随着ＰＭＡ激活ＰＫＣ，血小板发生聚集；（２）３５μｍｏｌ／ＬＰＧＦ１或１ｍｍｏｌ／Ｌｄｂ－ｃＡＭＰ不能抑制５０ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ诱导的血小板聚集，腺苷却能抑制ＰＭＡ诱导的血小板聚集（ＥＣ５０＝０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）．（３）ｄｂ－ｃＡＭＰ、腺苷都不能抑制１００ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ诱导的４０ｋＤ蛋白磷酸化，ＰＫＡ激活不能抑制ＰＭＡ激活的ＰＫＣ。（４）在ＰＭＡ、凝血酶激活的血小板中，ＰＫＣ、ＴＰＫ都发生激活，４０ｋＤ底物既是ＰＫＣ的底物又是ＴＰＫ的底物。结论：ＰＫＣ和ＴＰＫ在血小板聚集中起着重要的调节作用。     

仙珍骨宝防治激素所致大鼠骨质疏松的实验研究

目的：用骨组织形态计量学探讨仙珍骨宝对激素所致大鼠骨质疏松的影响。方法：２４只３月龄雄性ＳＤ大鼠，随机分为三组，每组８只。对照组喂生理盐水２ｍＬ／ｋｇ；激素组喂醋酸泼尼松（４．５ｍｇ／ｋｇ）２次／周；预防组除以激素组同法喂泼尼松外，每天还喂中药仙珍骨宝（蛇床子、淫羊藿等）水提液２ｍＬ／ｋｇ。处死大鼠前第１０天和第２天，分别给其皮下注射四环素（２５ｍｇ／ｋｇ）和Ｃａｌ－ｃｉｅｉｎ（５ｍｇ／ｋｇ），以便能在骨表面形成双层荧光，表明了分两次注射标记物期间骨形成的情况。３个月后，取下三组大鼠的胫骨上段用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，包埋块干后用低速锯锯成３００μ骨片，经磨成２０μ的薄片用图象分析仪进行计量学测算和分析。结果：激素组与对照组比较，动态参数中荧光标记周长和类骨质周长百分数分别减少了５６％（Ｐ＜０．０５）和４１％（Ｐ＜０．０５），矿化延迟时间增加了６３％（Ｐ＜０．０５），使骨形成减少；同时，骨吸收周长百分数增加了２６５％（Ｐ＜０．０５），提示骨吸收增加。从而出现静态参数中骨小梁面积和数量分别减少３８％（Ｐ＜０．０５）和３７％（Ｐ＜０．０５），导致了骨质疏松的产生。预防组与激素组相比，动态参数的荧光标记周长明     

洛伐他汀影响人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM转移相关能力的研究

目的研究洛伐他汀对人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM转移相关能力的影响。方法分别运用MTT法、Transwell小室法、细胞粘附人工重组基底膜实验检测洛伐他汀对HO-8910PM细胞的细胞毒作用,对细胞的侵袭能力和趋化运动及对细胞粘附能力的影响。结果洛伐他汀作用HO-8910PM细胞6h后能抑制其体外侵袭、趋化运动和粘附能力,其中8μmol/L抑制率分别为(79.18±0.21)%、(59.40±0.80)%和(14.08±1.28)%。结论洛伐他汀能有效地抑制人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM的侵袭、趋化运动和粘附能力,是潜在的抗肿瘤转移药物。     

蛋白激酶CK2结构与功能研究进展

蛋白激酶 CK2 ,曾称为酪蛋白激酶 (casein kinase ) ,是一种在真核细胞中普通存在的高度保守的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 ,是由两个催化亚基 (α和 /或α′)和两个调节亚基β构成的不均一四聚体[1 ] 。蛋白激酶 CK2底物众多 ,迄今发现有 2 0 0多种[2 ] ,这些底物在细胞功能的许多方面起重要作用 ,而且有些还是细胞复杂的信号加工系统的重要组成部分[2 ,3] 。许多研究表明 CK2α或 α′基因是潜在的癌基因 ,最近有研究表明 :CK2与 HIV- 1的关系非常密切 ,在 HIV- 1的复制、转录及裂解细胞等功能的调控中起着重要作用 ,CK2抑制剂具有抗…     

人蛋白激酶CK2 3个亚基cDNA的克隆与测序

目的构建人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基cDNA重组表达质粒深入进行CK2结构与功能的研究.方法利用RT-PCR、定向克隆和DNA测序等进行本实验.结果通过反转录PCR从HL-60细胞中获得了人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基编码区cDNA,将Nde I /HindⅢ双酶切的3种PCR产物分别与同样双酶切的表达载体pT7-7进行定向连接.CaCl2法分别转化DH5 α获转化子,快速提取质粒DNA进行电泳初筛得到阳性克隆.限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符.每种CK2亚基都各随机挑选4个阳性克隆,PEG法进行纯化.采用PE ABI的Big Dye荧光标记的终止底物循环测序试剂盒,使用各种引物进行正反向DNA测序.通过测序分别在每种CK2 α、α′和β亚基的4个阳性克隆中筛选到2个、1个和2个含完全正确的人CK2 α、α′和β亚基cDAN的重组质粒克隆,其余的克隆均存在1～2个碱基突变.我们将这种含正确序列的重组质粒分别命名为pTCKA、pTCKA′和pTCKB.结论CK2全套3个亚基重组质粒克隆的成功,将为在原核细胞中表达人CK2 α、α′和β亚基以及利用人CK2 α、α′和β cDNA作为探针进行深入研究打下基础.     

生物碱类钙通道阻滞剂对人白血病细胞株HL—60和K562的生长抑制作用

本文用粉防已碱(Ⅰ)、蝙蝠葛碱(Ⅱ)对培养的人早幼粒细胞白血病细胞株HL—60和红白血病细胞株     

5’—氯,5’—脱氧腺苷对凝血酶刺激的猪血小板中肌醇三磷酸(IP)生成的影响

本文用〔~3H〕—inositol标记血小板,冰冷的15％三氯醋酸终止反应,离心1,500g×10分钟,上清液用乙     

蛋白激酶C抑制剂Staurosporine对血小板聚集、肌动蛋白聚合的影响

本实验分别以阿斯匹林阻断花生四烯酸代谢,Apyrase去除ADP,研究蛋白激酶C在血小板聚集、肌动蛋白聚合过程中的作用。研究结果表明:蛋白激酶C在血小板激活过程中起着重要的调节作用,蛋白激酶C     

半边旗抗癌作用的实验研究

半边旗植物民间用作治疗消化系统急性炎症、跌打肿痛、疮疡(疒节)肿及毒蛇咬伤等症.本文将半边旗全草用水煎、乙醇浸泡及水煎液用乙醇沉淀三种方法提取其有效成分,然后检测它们对人早幼粒白血病细胞系